邓小燕 李飞龙 胡 宁 潘嘉川 汪长东

IFT80蛋白对肿瘤影响的研究*

邓小燕①李飞龙①胡 宁②潘嘉川③汪长东①

目的：探讨IFT80（intraflagellar transport 80）蛋白在骨癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、小肠癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌组织的表达分布情况与癌细胞增殖中的作用。方法：免疫组织化学研究IFT80的表达，免疫荧光和细胞培养研究抑制IFT80后对癌细胞增殖的影响和纤毛之间的关系。结果：1）IFT80在胃癌和肺癌组织中高表达，乳腺癌和小肠癌组织中中等表达，骨癌和卵巢癌组织中少量表达，前列腺癌和胰腺癌组织中几乎不表达；2）抑制IFT80后发现肺癌细胞增殖加快，纤毛减少变短；3）高分化，ⅡA期胃癌和正常胃组织中IFT80蛋白大量表达，而在低分化晚期，几乎不表达，在其他不同分化的胃癌中不同程度表达。结论：在不同癌组织中IFT80分布情况不一致。IFT80分布在细胞纤毛上，通过其表达的减少来调节纤毛的数量和长短参与癌细胞的增殖，故在严重癌组织中含量最低。

细胞原纤毛 IFT80 肿瘤 肺癌 胃癌

原纤毛存在于体内几乎所有类型的细胞，并突出细胞表面，是结构基础为微管的“毛发状”细胞器。在机体发育、细胞分化和增殖中原纤毛起着必不可少的作用，并参与液体运输和细胞运动，是各种信号通路的感觉中心，调控各种信号通路，其中比较典型的有Hedgehog信号通路和Wnt信号通路。纤毛形成的关键蛋白为IFT蛋白，有20种以上的IFT蛋白，分为IFT-A和IFT-B复合体［1］，IFT蛋白的突变可以导致各种纤毛疾病（ciliopathies）。研究发现人体内IFT80基因的突变可引起胸廓发育不良综合征（JATD）和短肋-多指Ⅲ型综合征（SRPIII）［2］，条件性基因敲除IFT80蛋白的动物实验发现类似JATD和SRPIII疾病的畸形的发生和缺陷的Hedgehog信号［3］，另外也有研究发现IFT80影响了光感受器的发育［4］。纤毛是各种类型的癌症发生发展的重要决定因素，在分子水平上，Hedgehog信号通路在各种类型的癌症中发现有异常的激活，IFT蛋白的缺陷可以引起Hedgehog信号的异常，可见IFT蛋白与癌症相关。但IFT80与肿瘤之间的研究尚少，彼此之间的联系尚不明确。本课题研究8种人肿瘤组织和胃癌组织，通过免疫组织化学，检测IFT80的表达，另外通过观察沉默IFT80表达后肺癌细胞的变化来探究IFT80与肿瘤之间的关联。

1 材料与方法

1.1 实验材料

8种诊断明确的人肿瘤组织，分别为骨癌（左股骨中上段转移性腺癌）、肺癌（右上肺中高分化鳞癌）、胰腺腺癌（中分化，并部分胰腺坏死）、胃癌（胃低分化腺癌，侵及全层）、小肠癌（小肠低分化腺癌，侵及外膜）、前列腺癌（Gleason积分6分）、乳腺癌（左乳腺癌）、卵巢癌（左卵巢，浆液性乳头状囊腺癌）。以上肿瘤切片均经重庆医科大学附属第一医院病理科确诊。IFT80抗体购于英国Abcam公司，DAB购自江苏碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学分析 8种肿瘤切片、不同分期的胃癌组织切片经二甲苯，系列浓度梯度乙醇脱蜡，3%H2O2常温孵育10 min，去除内源性的过氧化氢酶。胰酶37℃抗原复苏40 min，5%羊血清蛋白常温封闭1 h。IFT80蛋白抗体1：100（购自英国Abcam公司）4℃孵育16 h，对照组用PBS代替IFT80蛋白抗体，其余步骤相同。兔抗羊二抗（购自上海生工公司）1：200常温孵育1 h，DAB（购自江苏碧云天公司）显色，苏木素复染，自来水冲洗，树胶封片。光学显微镜观察照相（购自日本Olympus公司）。

1.2.2 A549肺癌细胞培养及分组 A549肺癌细胞株购自上海细胞所细胞库，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。所有实验均在细胞处于指数生长期进行。实验分为2组：control组和silence IFT80组，其中silence IFT80小干扰片段由上海吉玛制药技术有限公司合成。它们是Negative control：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，AC GUGACACGUUCGGAGAATT。1#IFT80：CAGCAAGAG UAUAGGUUUATT，UAAACCUAUACUCUUGCUGTT。2#IFT80：GGUGAAGACUGUAAAUAUAUATT，UAU AUUUACAGUCUUCACCTT。3#IFT80：GAGCAAACCA UGUGG GCUUTT，AAGCCCACAUGGUUUGCUCTT。经Real-time PCR实验发现，3#IFT80干扰片段抑制IFT80的抑制率达到90%，所以，后续实验均选择3#IFT80小干扰RNA片段。

1.2.3 A549肺癌细胞MTT值测定 96孔板待检测孔吸出培养液，加入新鲜培养基100 μL，同时加入MTT 20 μL，继续培养4 h，振荡10 min。在570 nm波长处，读取OD值。设置只加培养液的空白孔，用于调零。对照组为未加任何处理的A549肺癌细胞，测定培养的A549肺癌细胞1～6天的细胞增长情况，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 A549肺癌细胞原纤毛免疫荧光检测 A549肺癌细胞玻片，经二甲苯，系列浓度梯度乙醇脱蜡，3%H2O2常温孵育10 min，去除内源性的过氧化氢酶。胰酶37℃抗原复苏1 h，5%白蛋白常温封闭1 h。一抗4℃孵育16 h，PBS清洗后加入免疫荧光抗体标记，37℃孵育1 h后DAPI染色后PBS清洗后用甘油封片。激光共聚焦扫描显微镜观察，用Acetylated tubulin抗体（Ac-tub）（购自美国Sigma公司，T6793）标记细胞纤毛鞭毛，IFT80抗体标记IFT80蛋白，DAPI（购自Invitrogen公司）细胞核染色。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 11.0统计软件进行χ2分析和t检验。全部结果用±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 8种肿瘤组织中IFT80的表达

IFT80蛋白在胃癌组织（图1A）和肺癌组织（图1B）中高表达，细胞膜和细胞质均深度染色。中表达量的IFT80蛋白的肿瘤组织分别为乳腺癌（图1C）和肠癌（图1D）。少量表达IFT80的蛋白肿瘤组织是骨癌组织（图1E）和卵巢癌（图1F）。几乎不表达IFT80的蛋白的肿瘤组织是前列腺癌组织（图1G）和胰腺癌组织（图1H）。在人体8种肿瘤组织中，胃癌和肺癌中IFT80含量较多。

2.2 抑制IFT80对A549肺癌细胞的影响

为了研究IFT80基因影响肺癌细胞的增殖，选择肺癌细胞系A549细胞系作为研究对象，利用RNA干扰技术。沉默IFT80基因肺癌细胞和对照组肺癌细胞在（20倍）显微镜下表现，沉默IFT80基因A549肺癌细胞多为圆形，密度较大，常簇状分布（图2C），对照组为图2A。40倍显微镜下观察发现A549肺癌细胞呈球形或三角形，球形细胞与对照组相比在细胞中比例多（图2D），对照组为图2B。MTT法检测OD值，细胞生长曲线结果显示在细胞培养的1～6天组与control组相比，增殖的A549细胞多（图2E）。本实验结果提示了抑制IFT80表达可能诱导肺癌细胞增殖。

2.3 抑制IFT80对肺癌细胞纤毛的影响

为了观察沉默IFT80基因后，是否影响细胞原纤毛的数量和长度变化。在激光共聚焦显微镜下观察，发现在肺癌细胞系A549有细胞原纤毛（图3 control，Ac-tub；箭头所示纤毛顶端Acetylated tubulin）和IFT80蛋白（图3 control，IFT80；箭头所示IFT80蛋白）存在，IFT80蛋白表达在纤毛上。与control组相比，silence IFT80组IFT80蛋白表达减少，纤毛长度变短或者消失。本实验表明IFT80存在于细胞纤毛上，抑制IFT80可以造成细胞纤毛的减少或变短。

2.4 IFT80在不同胃癌分期的表达

由于前期实验发现胃癌组织大量表达IFT80，为了更深入的研究IFT80在胃癌不同分期的表达情况，本研究购买西安美艾生物科技有限公司的胃癌组织芯片（含正常胃组织，附TNM，临床分期和病理分期），利用免疫组织化学方法和特异性的IFT80抗体检测不同病理分期的胃癌组织。显微镜下观察胃癌组织，发现在高分化，ⅡA期胃癌组织和正常胃组织中IFT80蛋白大量表达（图4A，4L），而在低分化的胃癌组织晚期，IFT80蛋白几乎不表达（图4J，4K），而在其他不同分化的胃癌组织中IFT80蛋白不同程度表达。

▶A.Stomach cancer;B.Lung cancer;C.Breast cancer;D.Intestinal cancer;E.Bone tumor;F.Ovarian cancer;G.Prostate cancer;H.Pancreatic cancer图1 免疫组织化学染色IFT80在8种肿瘤组织中的表达（×10）Figure 1 Immunohistochemical staining for IFT80 expression in eight kinds of tumor tissues（IHC×10）

图2 沉默IFT80基因增强A549肺癌细胞增殖Figure 2 Silenced IFT80 gene increases A549 lung cancer cell proliferation

▶The arrow at the left picture marks acetylated tubulin,and the arrow at the middle picture marks the IFT80 protein图3 免疫荧光染色cilia在control组和silence IFT80组A549肺癌细胞中的表达（×40）Figure 3 Immunofluorescence staining for cilia expression in A549 lung cancer cells of the control and the silenced IFT80 groups（×40）

图4 免疫组织化学染色IFT80在不同胃癌分期中的表达（IHC×10）Figure 4 Immunohistochemical staining to detect IFT80 expression in various stages of gastric cancer（IHC×10）

3 讨论

现有研究发现IFT80通过调节Hedgehog信号通路在骨生成过程中起到了重要的作用［2］，并通过调节Hedgehog和Wnt信号通路影响软骨的分化［5］，可见其在细胞分化过程起着重要的作用。癌症的产生源自于细胞的分化异常，本实验研究了IFT80在8种癌组织中的表达情况，其中IFT80在8种癌组织中表达程度不同，其中在肺癌组织和胃癌组织中表达最多，而在前列腺和胰腺癌组织中几乎不表达，IFT80与癌症的产生可能存在着一定相关性。我们前期实验也检测了IFT20在此8种癌组织的表达情况。IFT20在卵巢癌中大量表达；在小肠癌、胃癌、乳腺癌中中量表达；在肺癌、胰腺癌、骨癌中低量表达；在前列腺癌中不表达［6］。而在相同的临床标本中检测IFT80，胃癌和肺癌组织大量表达IFT80；乳腺癌和肠癌中等量表达IFT80；骨癌和卵巢癌少量表达IFT80；IFT80在前列腺癌和胰腺癌组织中不表达。虽然IFT80和IFT20同属于细胞原纤毛的复合体B成分，同行使着逆向转运细胞信号物质的功能，但在相同的癌组织中表达情况不同，可能在调控肿瘤的生成过程中执行的功能具有差异，这需要更深一步的研究来证实此类假设。但实验结果显示，前列腺癌组织中均未检测到IFT80和IFT20蛋白的表达，可以推论前列腺癌的发生发展过程与细胞原纤毛和IFT80和IFT20蛋白无明显的相关性。

IFT80作为IFT蛋白的一种，而IFT蛋白是纤毛形成的关键蛋白，其IFT复合物起着装配和维持纤毛的作用［7］。本实验证实了IFT80蛋白存在于细胞纤毛上，并且IFT80随着纤毛在人类肿瘤组织中表达程度的不同而存在变化，实验发现在人类肿瘤组织中IFT80多表达在肺癌组织和胃癌组织中，在前列腺和胰腺癌组织中不表达，可见在肺癌组织和胃癌组织中纤毛的数量多而前列腺癌和胰腺癌组织中无表达，这与Shpak等［8］的研究结果相印证为纤毛在癌症器官组织中的数量多少可能与器官的功能有关，由于纤毛具有机械传感，信号传导等作用，故相比于前列腺和胰腺等，机械运动能力较强的肺与胃中纤毛存在多，所以在其癌组织中可以观察到较多的纤毛和IFT80蛋白。

IFT复合体沿轴丝微管进行双向物质运输，包括基底到纤毛顶端的正向运输和顶端到基底的逆向运输，IFT80蛋白同样参与了纤毛轴丝中蛋白的运输。本实验细胞免疫荧光研究发现IFT80蛋白分布和纤毛的分布重叠，多分布于纤毛轴丝上，通过抑制IFT80可以导致肺癌细胞纤毛的减少或变短，在显微镜（40倍）下观察可见三角形细胞数量的减少同样证明了抑制IFT80可以减少或变短纤毛，提示了IFT80的分布在纤毛上，而IFT80参与了细胞上纤毛的数量与长度的调节，但其详细机制还需要深入的研究。

本研究首次发现抑制IFT80可促进肺癌细胞的增殖，而低分化的晚期胃癌组织中IFT80蛋白的含量减少，这都提示了IFT80与癌细胞的增殖相关。在癌细胞的增殖过程中，IFT80的作用机制可能与癌细胞纤毛的减少或变短有关。纤毛的减少或者变短如何促进癌变细胞的增殖，可能在于多方面：1）中心粒的异常 增多 ：Polycystin-1（Pkd-1）和 Polycystin-2（Pkd-2）是位于纤毛膜上的蛋白，Pkd-1和Pkd-2的缺乏可以导致中心粒的增殖［9］，而异常增殖的中心粒可以促进着丝粒、中心体和非整倍体的异常，促进癌症的发生［10］。2）中心体缺陷：IFT80的缺失可能照成类似IFT20缺失引起的中心体缺陷，从而导致中心体移位，进一步引起有丝分裂过程中纺锤体的方向性异常而使细胞不能有序分裂，而引起细胞分化失常［11］。3）异常的Hedgehog信号：Shh是Patched（Ptc）可溶性配体，Ptc坐落在纤毛上，纤毛的减少不会影响到Shh配体，而在缺乏Shh时Ptc抑制了的Smoothened（Smo）的活性，当纤毛减少和短小时通过Shh刺激Ptc离开纤毛，从而解除对于Smo的抑制，相反的Smo进入了纤毛刺激Gli家族［12-13］，Gli家族蛋白，如Gli2，进入细胞核内上调相应的基因表达，从而加快细胞周期进程，促进细胞增殖［14～15］。在不同分化程度的胃癌组织中，本实验发现在高分化，ⅡA期胃癌组织和正常胃组织中IFT80蛋白大量表达，而在低分化的胃癌组织晚期，IFT80蛋白几乎不表达，并且在其他恶化程度的胃癌组织中IFT80蛋白表达有一个可见的梯度的变化，总的来说恶化程度越重，IFT80表达越少，可见IFT80可以做为一种新的诊断胃癌分期的检测指标，为在临床上制定胃癌的治疗方案提供一种新的参考。

本研究结果显示了在癌症组织中有IFT80蛋白的存在，并且各个器官中IFT80分布情况不一致，其多分布在机械运动功能强的纤毛数量多的器官中，如肺和胃。IFT80分布在细胞纤毛上，IFT80表达的减少可改变纤毛的数量和长短，从而通过多种途径直接或间接参与癌细胞的增殖，并且在胃癌组织中，IFT80表达的多少与癌症恶化程度相关。恶化程度越严重的胃癌组织中表达最少，而恶性程度低的胃癌组织中表达最多，如低分化的癌症晚期，其含量最低，几乎没有。综上所述，IFT80在癌症的增殖方面有着重要的作用，并且其可以做为一种新的诊断胃癌分期的诊断指标，但IFT80引起癌症的具体机制和如何诊断胃癌分期还需要进一步的研究。

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（2014-07-23收稿）

（2014-09-26修回）

（本文编辑：贾树明）

The effects of IFT80 proteins on tumors

Xiaoyan DENG1,Feilong LI1,Ning HU2,Jiachuan PAN3,Changdong WANG1

1Department of Biochemistry and Molecular Biology,Functional Genomics Lab,Molecular Medicine and Cancer Research Center,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3Department of Biomedical and Chemical Engineering,Syracuse University,Syracuse,New York 13244,United States of America

Chang-dong WANG;E-mail:cdwhust@163.com

Objective:To investigate Intraflagellar Transport 80(IFT80)protein expression in bone,lung,pancreatic,stomach,intestinal,prostate,breast,and ovarian cancers to explore its mechanism in cancer cell proliferation and to diagnose and identify new targets in cancer treatment.Methods:Immunohistochemistry was used to investigate the expression of IFT80 in gastric cancer tissue of different stages and in eight other kinds of human cancer tissues.We studied the relationship between cancer cell proliferation and inhibition of IFT80.Immunofluorescence method and cell culture were used to study the cilia and IFT80.Results:Results showed the following:a)the expression of IFT80 was high in gastric and lung carcinoma tissues,moderate in breast and colorectal cancers,low in bone and ovarian cancers,and nearly absent in prostate and pancreatic cancers;b)inhibition of IFT80 in the A549 cancer cell line accelerated cell proliferation and resulted in shorter,lower quality cilia;and c)IFT80 was abundantly expressed in cancer tissues of well-differentiated stage-IIA gastric cancer and normal gastric tissues,but was hardly expressed in late-stage,poorly differentiated gastric cancer.IFT80 could have various degrees of expression in gastric carcinoma of other stages and differentiation.Conclusions:Different cancer organs showed variation in IFT80 expression.IFT80 can be distributed in the organs with mechanical motion function,such as lungs and stomach.IFT80 is distributed on the cell cilia and can adjust the number and length of the cilia by reducing IFT80 protein expression.Through a variety of ways,IFT80 directly or indirectly participates in the proliferation of cancer cells.Thus,the lowest or nearly zero expression of IFT80 can be seen in cancer tissues of high-grade malignancy,such as advanced cancers with poor differentiation.

primary cilia,IFT80,tumor,lung cancer,gastric carcinoma

10.3969/j.issn.1000-8179.20141229

①重庆医科大学生物化学和分子生物学教研室，分子医学与肿瘤研究中心（重庆市400016）；②重庆医科大学附属第一医院骨科；③美国纽约州雪城大学生物医学与化学工程系

*本文课题受教育部博士点基金项目（编号：20125503120015）；重庆市自然科学基金项目（编号：cstc2014jcyjA10024，cstc2011jcyjA10033）和重庆医科大学基础医学院青年基金项目（编号：0800280031）资助

汪长东 cdwhust@163.com

This work was supported by the Doctoral Scientific Fund Project of the Ministry of Education of China(Nos.20125503120015) and the National Science Foundation of Chongqing(Nos.cstc2014jcyjA10024 and cstc2011jcyjA10033)and the Young Foundation of the School of Basic Medicine of Chongqing Medical University(Nos.0800280031)

邓小燕 专业方向为肿瘤分子生物学、肿瘤生物信息学。

E-mail：xydeng_cqmu@126.com