杨炳辉 高亦兵

（扬州出入境检验检疫局 江苏扬州 225009）

马铃薯Y病毒基因组连接蛋白的原核表达及纯化

杨炳辉 高亦兵

（扬州出入境检验检疫局 江苏扬州 225009）

设计合成马铃薯Y病毒基因组连接蛋白基因的特异引物，以本实验室获得的AQ4分离物cDNA为模板，通过PCR方法扩增得到目的基因，连入表达载体PEHISEGFPTEV 及 PEHISTEV，用IPTG诱导，使其在大肠杆菌中得到正确表达，并利用镍柱对VPg蛋白进行纯化，为抗血清的制备以及VPg蛋白晶体结构和互作蛋白的研究奠定基础。

马铃薯Y病毒；基因组连接蛋白基因；原核表达；蛋白纯化

1 前言

马铃薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）寄主非常广，主要危害马铃薯、烟草、番茄、辣椒和茄子等茄科作物，分布于所有的马铃薯种植区[1]。我国由北向南马铃薯的PVY带毒率依次增高，造成我国中部和南部地区不能自行留种，必须从东北、内蒙古等发病轻的地区调种，给生产造成了巨大损失[2]。因寄主品种和病毒株系不同，PVY可使马铃薯发生不同程度的症状，如坏死、枯斑及小叶黄化等，导致马铃薯退化，产量降低，损失高达80％[3]。当与其他病毒混合感染时，会产生粗缩花叶，损失更是十分严重[4]，因此，PVY与马铃薯卷叶病毒一样被认为是感染马铃薯的病毒中传播最为广泛，造成经济损失最为严重的病毒之一[5]。

PVY属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）[6]，病毒粒呈弯曲线状[7]，含有约10 Kb的单链正义RNA基因组；基因组5’末端有共价结合基因组连接蛋白（Virus genome-linked protein，VPg），3’端含有Poly （A）尾巴[8]；基因组中开放阅读框的两端含有非翻译区（UTR），只包含一个开放阅读框架（ORF），进行表达时先翻译成一个大的多聚蛋白，再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成小的、有功能的蛋白[9]。

VPg由NIa-Pro蛋白酶从NIa的N端水解下来，它的功能较多，可以通过与RNA聚合酶互作而作为病毒RNA复制酶的引物参与病毒复制[10]，也可参与病毒的细胞间运动和长距离系统侵染[11-12]，因此在病毒侵染循环中发挥着重要作用[13-14]。阐明VPg蛋白的功能，对揭示病毒整个生命过程的细胞生物学机制有着重要的促进作用，也可为抗病毒工程提供参考[15]。但由于受制于整个病毒细胞生物学的研究，目前对于VPg的研究还不够完全，它的许多功能仍未知晓。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

PVY AQ分离物：由山东农业大学植物病毒实验室分离并保存；大肠杆菌菌株DH5α、大肠杆菌Rossata：均由山东农业大学植物病毒实验室提供；原核表达载体pEHISEGFPTEV和pEHISETEV：由英国圣安德鲁斯大学刘焕庭教授馈赠；T4 DNA连接酶、dNTP、DNA分子量标准DL2000、无RNase的水、DNA聚合酶、限制性内切酶等：购自TaKaRa公司；DNA分子量标准DL2000 plus：购自北京全式金公司；PCR产物回收试剂盒：购自北京博大泰克公司；其他生化试剂及普通化学试剂：均为进口或国产分析纯；本研究所有引物：均由北京博尚生物公司合成。

2.1.2 仪器

高速离心机：Himac CR 22GⅡ；小型台式离心机：Eppendorf 5417R；-80℃超低温冰箱：SANYO MDF-382E；电子天平：METTLER TOLEDO AL104；蛋白质核酸测定仪：Ultra-Spec 2100；超微量分光光度计：Analytikjena Scandrop；PCR扩增仪：BioRad-MyCycler；凝胶成像系统：BIO-BEST 140E；制冰机：SIM IF300-500；超净工作台：AIRTECH SW-CJ-2FD；电泳仪：DYY-6C；水浴锅：SPC-6；高低温振荡培养箱：HZQ-F160A；pH计：PHS-3E；微量移液器：Eppendorf Research plus；磁力搅拌器：78-1；数码照相机：Canon G12。

2.2 方法

2.2.1 PVY VPg基因的克隆

本研究以PVY AQ分离物cDNA为模板，以VPg-F（CATGCCATGGGGAAAAATAAATCCAA AAGAATCC）和VPg-R（AAATGCGGCCGCTTA TTCATGCTCCACCTCCTG）为引物，扩增所需目的片段；引物两端分别引入Nco I和Not I酶切位点；PCR产物经1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；回收程序参照北京博大泰克公司B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒说明；回收产物与表达载体PEHISEGFPTEV及PEHISTEV用Nco I和Not I进行双酶切后经DNA连接酶连接，在4℃冰箱中连接过夜，转化大肠杆菌Rossata菌株。

2.2.2 目的基因的表达

从转化Rossata的LB板上挑取单菌活化后的菌液1：100稀释到10 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，227 rpm培养至OD600达到0.4-1；加IPTG至终浓度0.2 mmol/L，继续于37℃培养；在180 rpm摇培速度和相同IPTG浓度、相同时间下，设温度梯度（25℃，37℃）；在180 rpm摇培速度和相同IPTG浓度、相同温度下，设时间梯度（2 h、4 h、6 h、8 h）；在180 rpm摇培速度和相同温度、相同时间下，设IPTG浓度的梯度（0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/ L）；离心收集菌体，加适量TE溶液（pH 8.0），振荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min，SDS-PAGE电泳检测表达情况。

2.2.3 PVY AQ分离物融合蛋白的纯化

在冰上用10 mL样品缓冲液（1×PBS，含0.3 mol/L NaCl、10 mmol/L咪唑）重悬所得菌体，进行超声波破碎；4℃，12 000 rpm离心30 min；所得上清液用0.2 μm的过滤器过滤后，装到已用样品缓冲液平衡的Ni-NTA柱上，样品流速维持在1 mL/min；用3×（床）体积的漂洗缓冲液（1×PBS，含0.3 mol/L NaCl、30 mmol/L咪唑、1 mmol/L PMSF）洗涤，然后用洗脱缓冲液（1×PBS，含0.3 mol/L NaCl、250 mmol/L咪唑、1 mmol/L PMSF）洗脱；每次过柱皆要收集部分过柱后液体留样，洗脱产物全部收集；SDSPAGE分析含有蛋白的组分，并收集靶标蛋白；用含0.3 mol/L NaCl、1 mmol/L DTT、25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）的PBS对纯化的靶标蛋白透析2 h，中间更换1次透析缓冲液；收集纯化的蛋白以备TEV蛋白酶酶解或加入20％甘油，-70℃保存。

3 结果与分析

3.1 PVY VPg基因的克隆及表达载体的构建

本研究用PCR方法扩增了PVY AQ4分离物的VPg基因（图1），扩增片段长度约600 bp与预期结果（564 bp）一致。

将克隆的V P g基因连接到原核表达载体PEHISEGFPTEV以及PEHISTEV上，热激法转化Rossata，10-12 h后可看到白色菌落。挑取单菌落培养并提取质粒，进行PCR扩增和酶切鉴定，酶切后电泳检测，切下的片段所处位置与PCR扩增产物的位置相近（图2），含有目的片段的菌液可供诱导表达用。

图1 PCR扩增产物

图2 重组质粒VPg的酶切鉴定

3.2 目的基因的原核表达与SDS-PAGE分析

将经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒转化大肠杆菌Rossata，挑取单菌落接种于5 mL LB液体培养基中（含卡那霉素50 μg/mL），37℃活化过夜；1：100稀释到10 mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃，200 rpm，3 h，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，继续于25℃培养3 h；取菌液进行SDS-PAGE分析。结果表明在47 KD左右出现一条特异性蛋白带，符合预期表达融合蛋白的大小，说明外源蛋白已在大肠杆菌细胞中表达。

3.3 融合蛋白诱导表达条件的优化分析

根据所设时间梯度，时间越长，表达量越大，但6 h与8 h基本一致，增加的幅度较小；在不同浓度IPTG的诱导下，融合蛋白均能有效表达，且影响不大；根据菌液颜色判断，25℃优于37℃。试验结果详见图3、图4。根据上述研究结果确定融合蛋白在大肠杆菌Rossata菌株中诱导表达的最佳IPTG浓度0.2 mmol/L，诱导温度为25℃，诱导时间为6 h。

图3 37℃下融合蛋白在大肠杆菌中的表达

图4 25℃下融合蛋白在大肠杆菌中的表达

3.4 PVY VPg蛋白的纯化

将超声波破碎后含有目的蛋白的上清液装到已用样品缓冲液平衡的Ni-NTA柱上进行纯化，先用3×（床）体积的漂洗缓冲液漂洗杂蛋白，然后用洗脱缓冲液对目的蛋白进行洗脱，SDS-PAGE分析结果显示获得了比较纯的目的蛋白（图5），洗脱的目的蛋白肉眼可见明亮的绿色荧光（图6）。

图5 融合蛋白的SDS-PAGE

图6 纯化后融合蛋白的荧光

4 讨论

本研究利用表达载体pEHISEGPPTEV和PEHISTEV，在大肠杆菌Rossata菌株中成功表达了PVY 的VPg基因。VPg基因与GPF基因融合，菌液呈现强烈的绿色荧光。eGFP坚固的桶状结构能够很好的保护六肽生色团，而生色团只有在完整的蛋白中才会发出强烈的荧光。如果蛋白翻译不完整或者结构受到破坏，其荧光特性将会改变。因为目的蛋白与eGFP是融合表达且与eGFP具有相同的荧光特性，因此融合蛋白的荧光强弱与其表达量的多少成正比。根据绿色荧光的强弱，可以判断靶标蛋白的表达量。兰玉菲等用此方法成功表达了烟草脉带花叶病毒的cp基因[16]。

本实验构建了PVY VPg基因的原核表达载体，使其在大肠杆菌中得到了正确表达，并在表达条件的选择上进行了优化，诱导菌液的浓度、诱导时间、IPTG浓度、诱导温度等对蛋白的表达均有影响。对含重组转化子的大肠杆菌Rossata进行诱导时，接种的菌液必须新鲜，否则细菌的生长速度缓慢，在预定的时间内达不到诱导的浓度；加IPTG时，菌的生长浓度对基因是否表达非常重要，菌液浓度太高，表达效果不好，菌液浓度太低，则加IPTG之后细菌生长缓慢，OD600值在 0.4-0.6为最佳；诱导的时间一般为4-6 h，时间延长或过夜，效果反而不好；适宜浓度的IPTG会增加蛋白的可溶性，IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包含体），根据实验所设梯度，在一定范围内IPTG浓度对诱导表达量的影响并不大；实验证明，25℃条件诱导优于37℃，因为低温诱导可使蛋白缓慢合成，有利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白；为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑再降低温度，但表达总量可能会有所降低，故可以适当的延长诱导时间；由于实验室设备所限，低温诱导难以保障恒定的低温条件，增加了低温诱导的难度。因此，本实验采取25℃，IPTG浓度为0.2 mmol/L，诱导6 h获得大量的靶标蛋白，用于后续纯化实验。

本研究成功的表达和纯化了PVY AQ分离物的VPg基因，并利用HIS标签与镍柱特异性结合的特性，用镍柱纯化靶标蛋白，获得表现强烈绿色荧光的纯化蛋白，为抗血清的制备提供了条件。通过该融合蛋白制作的抗血清可用于转基因烟草的快速检测，可为检验检疫工作节省大量宝贵的时间。除此之外，本研究的结果还为VPg蛋白晶体结构的研究和互作蛋白筛选奠定了基础。

5 结论

本研究表达和纯化了PVY AQ分离物的VPg基因，并利用HIS标签与镍柱特异性结合的特性，用镍柱纯化靶标蛋白，获得表现强烈绿色荧光的纯化蛋白，并优化了蛋白表达的条件。实验证明，在25℃时，IPTG浓度为0.2 mmol/L，诱导6 h可获得大量的靶标蛋白，用于后续纯化实验。

［1］Fauquet C M, C R Pringle. Abbreviations for invertebrate virus species names[J]. Archive Virology, 1999, 144(11)： 2265-2271.

［2］ 周艳玲，刘学敏，孟玉芹. 马铃薯Y病毒的检测技术[J]. 中国马铃薯，2000，14(2)： 89-93.

［3］Whitworth J L, Nolte P, McIntosh C. Effect of Potato virus Y on yield of three potato cultivars grown under different nitrogen levels[J]. Plant Disease, 2006, 90： 73-76.

［4］ 高正良. 烟草马铃薯Y病毒病（PVY）的研究现状与防治对策[J]. 安徽农学通报，2003，9（5）：75-77.

［5］ 胡新喜，何长征，聂先舟. 马铃薯Y病毒研究进展[J]. 中国马铃薯，2009，23(5)： 293-299.

［6］King A M, Adams M J, Lefkowitz E. Virus taxonomy[R]. Ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, 2011.

［7］ 吴兴泉，陈士华，吴祖建，等. 马铃薯y病毒P1基因的克隆与序列分析[J]. 中国病毒学，2003，18（4）：376-380.

［8］ 李向东，于晓庆，古勤生，等. 马铃薯Y病毒属病毒基因功能研究进展[J]. 山东科学， 2006，19(3)：1-6.

［9］Riechmann J L, Lain S, Garcia JA. Highlights and prospects of potyvirus molecular biology[J]. Journal of General Virology, 1992, 73：1-16.

［10］ P uustinen P, Mäkinen K. Uridylylation of the potyvirus VPg by viral replicase NIb correlates with the nucleotide binding capacity of VPg[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(37)：38103-38110.

［11］Dunoyer P, Thomas C, Harrison S, et al. A cysteine-rich plant protein potentiates Potyvirus movement through an interaction with the virus genome-linked protein VPg[J]. Journal of Virology, 2004, 78(5)：2301-2309.

［12］Gao Z, Johansen E, Eyers S, et al. The potyvirus recessive resistance gene, sbm1, identifies a novel role for translation initiation factor eIF4E in cell-to-cell trafficking[J]. The Plant Journal, 2004, 40(3)：376-385.

［13］Murphy J, Rychlik W, Rhoads R, et al. A tyrosine residue in the small nuclear inclusion protein of tobacco vein mottling virus links the VPg to the viral RNA[J]. Journal of Virology, 1991, 65(1)： 511-513.

［14］Murphy J F, Klein P G, Hunt A G, et al. Replacement of the tyrosine residue that links a potyviral VPg to the viral RNA is lethal[J]. Virology, 1996, 220(2)： 535-538.

［15］胡正龙，肖旭倩，沈文涛，等. P型PRSV VPg 蛋白与寄主 eIF4e蛋白的互作[J]. 热带作物学报，2009，30（7）：1013-1018.

［16］兰玉菲，刘金亮，高瑞，等. 烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备[J]. 植物病理学报，2007，37(5)：461-466.

Prokaryotic Expression and Purifi cation of Potato Virus Y Virus Genome-Linked Protein

Yang Binghui, Gao Yibing
(Yangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yangzhou, Jiangsu, 225009)

In this study, the specific primers of virus genome-linked protein (VPg) gene of PVY were designed. And the VPg gene was obtained by PCR with the cDNA of AQ4 isolates as a template. Then the sequence was cloned into expression vectors PEHISEGFPTEV and PCRPEHISTEV. Induced with IPTG, the gene was expressed successfully in Rossata strain of Escherichia coli. We purifi ed VPg by Ni-NTA column, and the purifi ed VPg could be used for it’s antiserum preparation, and for exploration of it’s structure or it’s interacting proteins.

Potato virus Y; VPg Gene; Prokaryotic Expression; Protein Purifi cation

Q939.46