夏禹周, 李海红, 李红艳, 王 巧, 闫志英

(1.陕西省现代建筑设计研究院， 陕西 西安 710048; 2.西安工程大学 环境与化学工程学院, 陕西西安 710048; 3.中国科学院 成都生物研究所, 四川 成都 610041)

0 引言

我国作为农业生产大国，每年产生农作物秸秆多达7.6亿吨，其中稻草、玉米秆和小麦秆的数量约占秸秆总量的75 %.在秸秆利用方面，秸秆还田、饲用、燃烧及其它利用方式所占比例分别为24.3%、29.9%、35.3%和10.5%[1,2],其资源化问题已成为了研究的热点.

秸秆发酵制沼是一种将秸秆等有机质转化为可替代的清洁能源的技术，为秸秆资源化提供了一种有效途径.但发酵产气过程多受发酵原料的限制，主要原因是秸秆中的木质素、纤维素、半纤维素含量高，大分子相互缠结难以降解，厌氧菌消化困难，导致发酵启动慢，产气效率低[3,4].故需对秸秆进行预处理，以破坏秸秆内部的组织结构，提高厌氧消化效率和产气量.

目前，生物预处理被证明是木质素降解的有效途径[5].Karmakar S等[6]指出，单一的细菌、真菌、放线菌，尽管活性较高，但降解效果不如混合微生物菌群的共同作用.所以，近年来利用生物复合菌剂对秸秆进行预处理的研究备受关注.

本研究对4类复合菌剂进行拮抗实验，利用正交助手得到9组不同配比的复合菌剂.以玉米秸秆为原料，采用复合菌剂预处理秸秆，研究秸秆失重率以及木质素、纤维素及半纤维素的降解率.再利用预处理后的秸秆进行厌氧发酵产沼气，研究整个发酵过程的产气特性，探索不同复合菌剂对秸秆降解以及发酵产沼气的效果，为秸秆生物燃气工程的设计与运行提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

发酵材料玉米秸秆、接种物猪粪等均取自四川双流县太平镇郊区农民家里.复合菌种分为4类，即混合菌为一类,2株真菌(HX-1 和YJ-1-1)为一类,2株放线菌(Q0和2-9)+1株细菌Q3为一类,绿色木霉为一类.目标菌共7株，皆为实验室选育所得.

1.2 菌种拮抗实验

采用琼脂基础培养基：葡萄糖5 g，牛肉膏3 g，酵母粉3 g，蛋白胨10 g，MgSO4·7H2O22 g， 自然pH，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL.

1.2.1 真菌拮抗实验

将3种真菌(HX-1、YJ-1-1、绿色木霉)两两对点接种到同一培养基平板上，接种点之间的距离为3 cm，35 ℃下培养，观察菌落的生长状况，看其能否相容.

1.2.2 牛津杯法

混合菌、放线菌及细菌等不像真菌那样能蔓延生长，按参考文献[7]的牛津杯法两两进行拮抗实验(一个平板上共3个平行样).在培养过程中，如果两种菌相容，牛津杯周围就没有透明圈；如果两种菌不能相容，牛津杯周围就会产生透明圈.

1.3 菌种配比

利用正交助手设计软件，将4类菌种进行组合，得到9组不同的配比.把7株菌按照一定的比例混合，得到9组不同的复合菌液备用.各组编号记为A1、B2、…、I9,对照组记为J10.

1.4 秸秆堆沤预处理

预处理秸秆共10组，9组加不同配比的菌剂，1组不加菌剂作为对照组，实验编号和菌剂编号一致.每组秸秆(尺寸为1 cm左右)75公斤，按干秸秆量的0.5%加入复合菌剂，同时加尿素1公斤、并补加水至样品含水率约为70%，混合均匀后堆沤预处理6 d.然后，在6 d后采用范氏法(见文献[8])测定秸秆木质素、纤维素、半纤维素的降解率.

1.5 厌氧发酵产沼气

选用500 mL广口瓶作为发酵瓶，发酵原料包括预处理秸秆、猪粪(氮源补充物)、水等.加入的接种物为发酵原料的20%，补加水量，使发酵液的总固体浓度(TS)为8%，将发酵原料混合均匀，投加于发酵装置中，于35 ℃恒温培养箱中发酵30 d.每日采用安捷伦7890A气相色谱仪测定甲烷浓度，采用排水集气法测定产气量.

实验分为10个组.其中，9组为经不同复合菌剂处理后的秸秆发酵，1组为未经菌剂处理后的秸秆发酵.每组3个平行，实验编号和菌剂编号一致.

2 结果与讨论

2.1 菌种拮抗实验结果

在真菌培养基平板上的第2 d就可长出菌丝，第3 d就可相互融合生长，如图1所示.平板上的红色是因为培养基中加入了0.03%的孟加拉红，便于观察.图1(a)与图1(b)表明，三种真菌之间均无拮抗，可以混合生长.

(a)真菌HX-1和YJ-1-1

(b)真菌YJ-1-1和绿色木霉图1 真菌拮抗实验结果

其它菌种的牛津杯周围都没有透明圈产生，如图2所示.这说明菌株彼此也可以共同生长.因此，后续实验对这7种菌株进行混合配比.

图2 混合菌和放线菌Q0拮抗实验结果

2.2 菌种配比

根据正交助手设计软件获取菌种配比，以体积比为指标，菌液浓度相同.配比结果如表1所示.

表1 菌种配比(体积比)

2.3 预处理秸秆失重结果

秸秆堆沤过程中，堆体的初始温度为35 ℃，到第3 d温度上升且开始基本稳定在55 ℃～62 ℃.随着温度上升，菌体生长旺盛，复合菌剂加速秸秆降解.当温度稳定时，堆沤环境成熟，秸秆降解速率稳定.此时,根据秸秆前后质量及含水率计算秸秆失重，其结果如图3所示.

图3 预处理秸秆失重率

从图3可知，9组实验组的秸秆失重率依次为6.31%、14.2%、21.79%、26.61%、18.71%、23.97%、13.5%、14.71%、25.38%，对照组的秸秆失重率为12.16%.

其中,D4组的秸秆失重率最高，比对照组失重率高出1倍多.这说明D4组配比得到的复合菌剂具有较强的秸秆降解能力，能有效利用秸秆中的木质纤维成分，造成秸秆的质量减少.其次为I9组，而A1组的失重率最低，这是因为秸秆表面会附着少量自然环境中的菌体，这种菌体比A1组复合菌剂对以秸秆为基质的生存环境具有更强的适应能力.

2.4 预处理秸秆木质素、纤维素、半纤维素降解率

堆沤预处理第6 d，菌剂预处理后的秸秆表面布满了较多的白色菌丝，秸秆变得更为疏松柔软，说明秸秆中的木质纤维结构已被菌剂中含有的纤维素、木质素等高效分解菌破坏.通过范氏法测定秸秆中木质素、纤维素及半纤维素的降解效率，其结果如图4所示.

图4 预处理秸秆木质素、纤维素、半纤维素降解率

从图4中可以看出，10组秸秆组分的降解率皆为：半纤维素>木质素>纤维素.这是因为玉米秸秆中的纤维素、半纤维素不但被木质素包裹，而且部分半纤维素和木质素以共价键结合，形成紧密的结构.木质素[9]是由苯丙烷结构单元组成的复杂芳香族高聚体，属于非水溶性难降解物质，而木质素的包裹对水解纤维素起到屏障作用，阻碍了纤维素碳水化合物的酶解，所以纤维素的降解效率最低.而半纤维素主要由糖类物质组成，属于易降解物质，所以预处理过程中保持较高的降解率.

其中，D4组的木质素、纤维素、半纤维素的降解率最高，依次为46.16%、38.60%、53.14%，其次为I9组，降解率最低为A1组，不及对照组的降解率.这三种物质的降解率与秸秆失重率相对应.这说明不同菌剂配比对秸秆的预处理效果不一样.D4组的复合菌剂较其它菌剂组合，对秸秆木质纤维素有很强的分解破坏能力，更容易转变并利用木质纤维素，提高秸秆在后续发酵过程中的可利用性.

2.5 厌氧发酵产沼气

2.5.1 复合菌剂对秸秆产气量的影响

产气量是厌氧消化过程中的一个重要参数，直观地反映了厌氧消化系统的产气性能，是判断厌氧消化过程好坏的重要依据.30 d的厌氧发酵周期内，10组秸秆发酵的日产气量及累计产气量结果分别如图5、图6所示.

发酵瓶从进料开始，到能够正常而稳定的产气过程称为沼气发酵的启动[10].从图5可以看出，装料当天即开始产气，表明10组秸秆在常温下均能很快启动厌氧发酵.这是因为实验是在夏末季节进行的，气温较高(室温24 ℃～30 ℃)，利于菌群生长.装料后第2 d出现了第一个产气高峰期，主要成分为CO2.A1组至J10组的日产气量依次为：457 mL/d、535 mL/d、765 mL/d、552 mL/d、562 mL/d、670 mL/d、520 mL/d、640 mL/d、950 mL/d、795 mL/d.其中，I9组预处理后的秸秆日产气量最大，而A1组产气量最少.在发酵初期， 发酵原料中的猪粪被复合菌群迅速利用而不断减少，同时秸秆中的纤维素还没有被完全降解利用，因此发酵料液的日产气量逐渐下降.

随着反应的继续进行，秸秆中的纤维素被不断降解，甲烷菌的活性提高，进而出现了第2个产气高峰.第2个产气高峰期各组出现时间不一致，大致在13～20 d内.A1组至J10组分别于第19 d、第17 d、第13 d、第18 d、第19 d、第13 d、第19 d、第20 d、第15 d、第14 d时的日产气量达到最高，分别为442 mL/d、454 mL/d、514 mL/d、478 mL/d、476 mL/d、500 mL/d、449 mL/d、457 mL/d、609 mL/d、473 mL/d.其中I9组最高，高出对照组28.8%.

图5 30 d发酵日产气量

玉米秸秆的产气率与其纤维素、木质素、可溶性糖、蛋白质含量等相关，与细胞壁中的木质素、纤维含量呈负相关.此外，秸秆细胞壁的组成也直接影响纤维素的消化率[11].从图6可知，秸秆发酵30 d内，I9组的累积产气量最高，为10 413 mL，这和此秸秆经过I9复合菌剂降解后，细胞壁中的木质素、纤维素含量大幅度下降有关，如图3所示.秸秆结构变疏松，纤维素、半纤维素与微生物的接触面增大，易降解物质量相应提高，导致其消化率明显提高，产气量上升；累积产气量最低的组为第7组，为6 540 mL，J10对照组为7 623 mL.9组实验组中只有I9、F6、C3组累积产气量比对照组高， 分别高出36.6.%、14.4%、8.3%.

图6 30 d发酵总产气量

实验说明，采用合适的菌剂配比预处理秸秆能很大程度地提高沼气产生量.秸秆的生物预处理实际就是利用自然环境中的沼气微生物将纤维素等原料进行分解，完成沼气发酵过程中的液化和产酸两个阶段的任务，以缩短沼气发酵的停滞期，加速沼气发酵的全过程.

2.5.2 复合菌剂对秸秆产甲烷量的影响

经过30 d的厌氧发酵，10组秸秆发酵的日产甲烷量结果如图7所示.

图7 30 d发酵日产甲烷量

沼气是以CH4为主的一种混合型可燃气体，在稳定的发酵阶段，沼气的主要成分是CH4和CO2，还有少量的CO、H2S、O2、N2等气体[12].从图7中可以看出，10组秸秆在发酵第1 d时都能产CH4，但含量并不高，这是因为发酵初期，沼气池中水解酶类活性较高，纤维素等分解菌活跃，发酵体系产生的CO2量大，挥发性有机酸等中间产物多，所以沼气中CH4含量偏低，反映了沼气发酵启动阶段的特征[13].

第2 d出现产CH4的第1个高峰期.其中，I9组预处理后的秸秆日产CH4量最大，为417 mL/d ，高出对照组19.1%，甲烷的体积分数为44%.C3组次之.第2个高峰期大致在13～20 d，这和日产气量的趋势基本一致.C3、F6、I9组分别于第15 d、第16 d、第17 d时日产CH4量达到最高，分别为334 mL/d、334 mL/d、416 mL/d，高出对照组9.2%、9.2%、35.9%，其余组都不及对照组，且I9组的甲烷体积分数为68%，达到了最大值.30 d内，I9组的累积产甲烷量最多，达6 074 mL，高出对照组39.0%.这说明复合菌剂预处理能较大地提高秸秆产气量和消化效率，但降解率和产气量并不成正比，降解率高可能会导致发酵原料营养不足，产气量减少.

3 结论

(1)菌种拮抗实验表明复合菌、真菌、放线菌及细菌、绿色木霉等4类复合菌种(7种菌株)之间无拮抗，能相互共生长，混合配比后得到9组复合菌剂.

(2)复合菌剂预处理秸秆实验表明，D4组秸秆失重率及木质素、纤维素、半纤维素的降解率最高，依次为26.61%、46.16%、38.60%、53.14%；其次为I9组，其值分别为25.38%、39.1%、35.5%、48.5%.10组预处理秸秆的木质素降解率都大于纤维素降解率.

(3)秸秆厌氧发酵产沼气实验表明， I9菌剂处理后的秸秆发酵效果最好.在30 d发酵周期内，出现两个产气和产CH4高峰期，其累积产气量和产CH4量分别可达10 413 mL、6 074 mL，高出对照组36.6%、39.0%.说明采用合适的菌剂配比预处理秸秆能较大地提高秸秆产气量和消化率.

D4组的木质纤维降解率虽最高，但产气并不是最高的.说明降解率和产气量并不成正比，降解率高可能会导致发酵原料营养不足，产气量减少.因此，选择最佳复合菌剂配比为I9组，即复合菌、真菌、放线菌及细菌、绿色木霉的体积比为3∶3∶2∶1.

[1] 楚莉莉,李轶冰,冯永忠,等.猪粪麦秆不同比例混合厌氧发酵特性试验[J].农业机械学报, 2011,42(4):100-104.

[2] 高利伟,马 林,张卫峰,等.中国作物秸秆养分资源数量估算及其利用状况[J].农业工程学报,2009,25(7):173-179.

[3] 周 玮,董保成,齐 岳.不同处理秸秆中温厌氧发酵的产气效果[J].中国沼气，2010,28(3):22-24.

[4] 张 望,李秀金,庞云芝,等.稻草中温干式厌氧发酵产甲烷的中试研究[J].农业环境科学学报,2008,27(5):2 075-2 079.

[5] 李海红,常 华,袁月祥,等.复合菌剂预处理对秸秆厌氧发酵的影响[J].西北大学学报(自然科学版),2012,42(6):949-952.

[6] Karmakar S,Greene H L.Oxidative destruction of chlorofluorocar-bons by zeolite catalysts[J].J Catal,1992,138:364.

[7] 刘冬梅,李 理,杨晓泉,等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006,27(3):110-111.

[8] Goering H K,Van Soest P J.Forage fiber analysis USDA-ARS agric.handbook[M].Washington:Gov.Print,1971:387-598.

[9] Kirk T K,Farrell R L.Enzymatic combustion:the microbial-degradation of lignin[J].Annu.Rev.Microbiol.,1987,41(1):465-505.

[10] 高礼安,邓功成,赵 洪,等.C/N对沼气产气量的影响[J].安徽农业科学，2009,37(15):6 879-6 880.

[11] Ward J D,Redfearn D D,Mc Cormick M E,et al.Chemical composition,ensiling characteristics,and apparent digestibility of summer annual forages in asubtropical double-cropping system with annual ryegrass[J].Journal Dairy Science,2001,84:177-182.

[12] 李世密,魏雅洁,张晓健,等.秸秆类木质纤维素原料厌氧发酵产沼气研究[J].可再生能源，2008,26(19):50-53.

[13] 陈忠斌.生物芯片技术[M].北京:化学工业出版社,2005:352-358.