何明祥

(福建省福州市工业产品生产许可证审查技术中心,福建福州 350008)

蛇六谷是上海地区魔芋的俗称,为天南星科魔芋和疏毛魔芋的块茎,有化痰散结、行瘀消肿等功效[1-2],是最早被用于治疗痈疖、肿、毒的特色药材之一.据相关报告[3-5],蛇六谷具有抗肿瘤功效,现广泛用于各种癌肿,为治疗肿瘤的特色药材之一[6-9].目前的蛇六谷研究大多集中在中药水煎剂,同时大多研究直接采用提取物进行实验,未进行分离纯化,活性物质成分不明,结构分析未见报道,不利于作用机理的研究[10-11].

本课题以蛇六谷为研究对象,利用自制蛇六谷葡甘聚糖降解产物,通过实验探讨蛇六谷葡甘聚糖短链分子抗肿瘤作用,为蛇六谷葡甘聚糖的抗肿瘤作用及其机制提供有效依据,希望为蛇六谷这一抗癌中药的进一步开发利用提供理论指导.

1　材料与仪器

1.1　实验材料

昆明种小鼠,质量18～22 g,由广东医学院动物实验中心提供;宫颈癌细胞株(HeLa细胞),中国科学院上海药物研究所肿瘤室提供;S180腹水型肉瘤小鼠,引自陕西省中医药研究院;蛇六谷葡甘聚糖,用超声波法制得.

1.2　仪器设备

HH-4型恒温水浴锅,江苏省金坛市宏华仪器厂;RE-52型减压旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;DZF-6021型真空干燥箱,上海精密实验设备有限公司;LGJ型冷冻干燥机,北京四环科学仪器厂;AUW220D型电子天平,日本岛津公司;离心机,北京医用离心机厂;CO-15AC CO2型恒温培养箱,日本SANYO公司;SW-CJ-1FD型洁净工作台,苏净安泰;XDS-18型生物倒置显微镜,重庆水电仪器总公司;TE2000型倒置荧光显微镜,日本NIKON公司;DSX-280A型不锈钢灭菌锅,上海申安医疗设备.

2　实验方法

2.1　蛇六谷葡甘聚糖短链分子预处理[12-14]

精密称取蛇六谷葡甘聚糖短链分子50 mg,溶解于200μL二甲基亚砜(DMSO)中,旋转震荡,待全部溶解后,0.22μm过滤器过滤,少量分装后-20℃保存,将其质量浓度稀释为250 g/L.

2.2　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对HeLa增殖的抑制率测定[12-13,15-16]

1)将人宫颈癌细胞HeLa细胞株接种在质量分数为10%胎牛血清中,加入具有1%抗生素、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI-1640(Gibco)培养液中,37℃,5%CO2培养箱中培养.

2)取处于对数生长期的HeLa细胞经胰酶消化后,调整细胞密度为1×105个/mL,接种到96孔培养板.

3)每孔0.1 mL,培养12 h,待细胞完全贴壁后,加入用RPMI-1640培养液配制的各浓度样品(50,100,200,400,800μmol/L),每个浓度均做 3个复孔.

4)培养48 h后,每孔加入MTT 15μL,继续培养4 h,离心条件弃去上清液,加入150μL DMSO,振荡10 min,于酶标仪上在490 nm进行比色测定,其平均值为细胞存活的光密度,计算每个样品的细胞抑制率.

2.3　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺、脾指数的影响实验[14,16-17]

昆明小鼠,雄性,4～6周龄,体重(20±2)g,自由进食.从预先培养的荷瘤小鼠腹腔中抽出含S180的腹水,用无菌生理盐水稀释.摇匀后,取此细胞液加台盼蓝(trypanblue)染色,计数,细胞存活率在95%以上.将S180细胞悬液0.2 mL接种于实验小鼠的右前肢腋皮下,制备移植瘤模型.接种24 h后称小鼠体重,并随机分为5组.空白对照组与环磷酰胺25 mg/(kg·d)组分别为阴、阳性对照组,过氧乙酸(PPA)用无菌生理盐水溶解,从高到低设4个剂量组,分别为600,400,200,100 mg/(kg·d).接种24 h后灌胃给药,每天1次,共给药10 d.停药后第2天脱颈处死荷瘤小鼠,称体重,分离瘤块等称重.

3　结果与分析

3.1　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对HeLa细胞增殖的影响

表1为蛇六谷葡甘聚糖短链分子与HeLa细胞生长的关系.从表1可以看出,随着蛇六谷葡甘聚糖短链分子质量浓度的增大,HeLa细胞吸光度降低,对其生长的抑制率逐渐提高,当蛇六谷葡甘聚糖短链分子质量浓度达到8.0 g/L时,对HeLa细胞生长的抑制率可达到10.98%.实验表明,在一定浓度范围内,HeLa细胞生长抑制率与蛇六谷葡甘聚糖短链分子的质量浓度成正相关,因此,蛇六谷葡甘聚糖短链分子能够抑制HeLa细胞的生长,但总体抑制效果不明显.

表1　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对HeLa细胞生长的影响Tab.1　Effects of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli on growth of HeLa cells

表2　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对S180荷瘤小鼠瘤重的影响Tab.2　Effects of KGM short chain polymer of rhizoma amor-phophalli on tumor weight of S180 tumor bearing mice

3.2　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺、脾指数的影响

表2为蛇六谷葡甘聚糖短链分子与S180荷瘤小鼠瘤重的关系.从表2可以看出,在生理盐水实验组中,经检测S180荷瘤小鼠的肿瘤质量为0.904 4 g;当加入低浓度的蛇六谷葡甘聚糖短链分子时,肿瘤质量为0.814 2 g,抑制率为9.97%;当加入中浓度的蛇六谷葡甘聚糖短链分子时,肿瘤质量为0.637 3 g,抑制率为29.53%;当加入高浓度的蛇六谷葡甘聚糖短链分子时,肿瘤质量为0.587 7 g,抑制率为35.02%.结果表明,不同剂量蛇六谷葡甘聚糖短链分子对S180荷瘤小鼠肿瘤的增长都有抑制作用,且随着剂量的增大,抑制效果越明显,但当剂量达到一定值时,剂量继续增大,抑制率不再变化;同时蛇六谷葡甘聚糖短链分子的抑瘤效果要明显低于阳性对照样品环磷酰胺.

表3为蛇六谷葡甘聚糖短链分子与S180荷瘤小鼠胸腺、脾指数的关系.从表3可以看出,当加入低浓度的蛇六谷葡甘聚糖短链分子时,胸腺指数为8.7×10-4,脾指数为6.64×10-3;当加入中浓度的蛇六谷葡甘聚糖短链分子时,胸腺指数为9.7×10-4,脾指数为7.25×10-3;当加入高浓度的蛇六谷葡甘聚糖短链分子时,胸腺指数为9.7×10-4,脾指数为8.03×10-3.结果表明,不同剂量蛇六谷葡甘聚糖短链分子都可以提高S180荷瘤小鼠胸腺、脾指数,但低剂量蛇六谷葡甘聚糖短链分子对胸腺指数影响不大,同时当剂量达到一定值时,剂量继续增大,胸腺、脾指数不再变化.

表3　蛇六谷葡甘聚糖短链分子对S180荷瘤小鼠胸腺、脾指数的影响Tab.3　Effects of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli on thymus and spleen indexes of S180 tumor bearing mice

4　蛇六谷葡甘聚糖降解产物结构分析

4.1　蛇六谷葡甘聚糖降解产物的X射线衍射分析

X射线衍射分析方法可用来分析物质内部原子在空间分布状况的结构,根据获取到的衍射图谱判断物质的构型.蛇六谷葡甘聚糖降解产物的X射线衍射图见图1.图1中,衍射图谱在16°这个位置附近出现了相对较强的结晶峰,这说明提取出的蛇六谷葡甘聚糖短链分子中存在结晶有序结构,而无序结构则会呈现出一个馒头状的弥散环.这说明经过超声波降解得到的蛇六谷葡甘聚糖短链分子是由β-型糖苷键链接的,其可能具有较好的抗肿瘤活性.

图1　蛇六谷葡甘聚糖短链分子的X射线衍射图Fig.1　X-ray diffraction of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

4.2　蛇六谷葡甘聚糖降解产物的红外光谱分析

红外光谱可以测定蛇六谷葡甘聚糖短链分子的糖苷键构型及观测其他官能团.蛇六谷葡甘聚糖降解产物的红外光谱见图2,从图2可知,在885 cm-1附近存在的吸收峰表明,体系中含有β-糖苷键,说明超声波降解得到的蛇六谷葡甘聚糖短链分子中存在β键,这与X射线衍射分析的结果相符.而图中在3 430 cm-1处有O—H伸缩振动的强吸收峰,说明此条件下体系含有大量的羟基(—OH),其在分子间缔合时,可以形成以氢键相连的多聚体,吸收位置移向更低波数;在2 920 cm-1出现吸收峰,此处是甲基与亚甲基的C—H伸缩振动峰,而在1 640 cm-1附近出现═C O吸收峰,峰形尖锐,显示体系分子链中有乙酰基存在.

图2　蛇六谷葡甘聚糖短链分子的红外光谱Fig.2　Infrared spectroscopy of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

4.3　蛇六谷葡甘聚糖降解产物的拉曼光谱分析

为了进一步了解分子振动的信息,在红外光谱的基础上,进而对降解后的蛇六谷葡甘聚糖短链分子进行拉曼光谱分析,见图3.根据图3及结合蛇六谷葡甘聚糖短链分子结构研究的有关理论,对图3中各拉曼光谱吸收峰进行归类分析,结果如表4.

图3 蛇六谷葡甘聚糖短链分子的拉曼光谱Fig.3　Raman spectra of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

图3中,蛇六谷葡甘聚糖短链分子的C—H的伸缩振动出现在2 900,1 118,1 090 cm-1处,C—O—C的伸缩振动则出现在905 cm-1处.

表4　蛇六谷葡甘聚糖样品的激光拉曼光谱吸收峰归属Tab.4　Laser Raman band assignments of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

4.4　蛇六谷葡甘聚糖降解产物的圆二色谱分析

利用圆二色谱(CD)可以对高分子物质的高级构象进行分析,通过测定高分子溶液的圆二色谱可以研究其构象和其转变规律[1],尤其是揭示了蛋白质的α-螺旋、β-折叠的高级结构以及部分参数,并被研究者尝试应用于多糖构像的研究[2-3].图4为超声波降解得到的蛇六谷葡甘聚糖短链分子在水溶液中的CD谱图,图中,在波长为180～400 nm时,蛇六谷葡甘聚糖短链分子在226 nm处出现显著负cotton效应,说明蛇六谷葡甘聚糖短链分子在水溶液中以有序的螺旋结构存在.

图4　蛇六谷葡甘聚糖的圆二色谱Fig.4　CD spectra of KGM short chain polymer of rhizoma amorphophalli

5　结 论

参考文献：