徐春明, 李　婷, 王英英, 庞高阳, 刘　颖

(北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心/北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048)

荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)为木兰纲(magnoliopsida)蓼目(polygonales)蓼科(polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)双子叶药食两用作物.荞麦主要有两个栽培种,分别为鞑靼荞麦(苦荞)(Fagopyrum tataricum(Linn.)Gaertn.)和普通荞麦(甜荞)(Fagopyrum esculentum Moench).我国荞麦分布较广,华北、西北、东北地区多种植甜荞,而西南地区的四川、云南、贵州等省则多种植苦荞[1].苦荞麦比小麦、稻米等谷物含有更丰富的黄酮、膳食纤维、维生素及矿物质等对人体有益的物质[2].苦荞麦的籽粒、根茎叶及花都含有黄酮类物质,这些黄酮类物质的主要成分为芦丁,占总黄酮的70% ～80%[3].黄酮类化合物在降血糖、抑菌抗炎症、治疗心血管疾病、抗肿瘤、增强机体免疫力等方面都有明显作用[4-5].从苦荞麦中提取黄酮类化合物的传统提取方法有醇类提取、热水提取、碱提取、柱层析及其他溶液提取法.微波辅助提取法近年来广泛应用于天然活性成分的提取,可提高目标物从固相转移到液相的传质速率,从而提高提取产率[6];基于乙醇、异丙醇等有机物与无机盐形成的新型双水相体系与传统的双水相体系,即高分子聚合物/盐体系相比,成本更低,萃取相不含黏度大、难处理的聚合物,且表现出良好的分离性能[7-8].本实验研究乙醇-硫酸铵双水相提取苦荞麦粉中黄酮类化合物的提取条件(确定较优乙醇体积分数以及硫酸铵添加量);通过单因素实验初步优化苦荞麦粉中黄酮类化合物的提取条件,并利用响应面法进一步优化微波辅助双水相提取苦荞麦粉黄酮类化合物的提取条件.

1　材料与方法

1.1　实验材料

苦荞麦粉,在北京永辉超市购得苦荞麦,用粉碎机粉碎并过40目筛制得;无水乙醇,分析醇,北京化工厂;硫酸铵,分析纯,天津市光复科技发展有限公司;芦丁标准品,色谱纯,生工生物有限公司;氢氧化钠,分析纯,天津市光复科技发展有限公司;亚硝酸钠,分析纯,天津市光复科技发展有限公司;水合硝酸铝,分析纯,北京市汇海科仪科技有限公司.

1.2　仪器与设备

AL204型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;NC28105型微波萃取仪,Cemcorporation公司,SB25-120型超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;D-37520型离心机,Sigma laborzentrifugen公司;TD5A型离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;SpectraMAX190型酶标仪,Molecular Devices;FW400A型万能粉碎机,北京中兴伟业有限公司;HH-4型水浴锅,华港通国际有限公司;Eppendorf 96孔板,Eppendorf中国有限公司.

1.3　实验方法

1.3.1提取黄酮类化合物

参考文献[9],提取苦荞麦粉中黄酮类化合物.将过40目筛的苦荞麦粉,放入烘箱中,温度恒定为60℃,烘干,待物料恒重后取出,密封袋包装好,称重,备用.准确称取5.00 g苦荞麦粉于200 mL溶剂中,首先静置约10 min,目的是为了让苦荞麦粉在微波前更好的浸透于溶剂中,从而提高微波提取效率.后进行微波辅助提取,提取结束后进行离心5 000 r/min,15 min,后取上清液,加入硫酸铵,静置,分相.上层液体为乙醇相.将两相分离,将上层液体进行离心,5 000 r/min,5 min,取上清液,妥善保存,待测.最后测上清液黄酮含量,取上清液2 mL于10 mL容量瓶,定容,摇匀,用96孔板测其吸光度,并对照芦丁标准曲线计算黄酮类化合物含量及其提取率,每次实验重复3次.

1.3.2总黄酮含量测定

准确称取0.10 g芦丁,置500 mL烧杯中,加入乙醇溶解,后转移置500 mL容量瓶中,定容,制得质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液.用移液管准确量取芦丁标准品溶液0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,分别加乙醇溶液至3.0 mL,加ω(NaNO2)为5%的水溶液0.3 mL,摇匀,放置6 min,加 ω(Al(NO)3)为10%的水溶液0.3 mL,摇匀,放置6 min,最后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,再加入φ(乙醇)30%的溶液定容至刻度线,摇匀,放置15 min,在510 nm波长处测定吸光度.以吸光度为纵坐标;芦丁标准品的质量浓度为横坐标,mg/L,绘制标准曲线,见图1.

图1　芦丁标准曲线Fig.1　Standard curve of rutin

计算回归方程为y=0.004 2x-0.002 9(R2=0.998 7),确定了0～60 mg/L芦丁吸光度与质量浓度的线性关系.

1.3.3双水相体系的确定及单因素实验

确定苦荞麦粉中黄酮类化合物提取的较优乙醇体积分数以及硫酸铵添加量.以微波提取时间、微波提取功率、料液比为因素进行单因素实验,考察各个因素分别对苦荞麦粉黄酮得率的影响.

1.3.4Box-Behnken试验设计与数据处理

在单因素实验基础上,采用Box-Behnken试验设计方法,确定自变量,以苦荞麦粉总黄酮得率为响应值,采用响应面分析法安排实验以获取较佳提取条件,并用Design-Expert 7软件进行数据分析.

2　结果与讨论

2.1　苦荞麦粉黄酮类化合物提取的较优乙醇体积分数以及硫酸铵添加量

2.1.1乙醇体积分数的确定

通过预实验研究表明乙醇-硫酸铵双水相在乙醇体积分数为18%～55%范围内,添加适量硫酸铵时乙醇-硫酸铵可以分成两相.本实验在此基础上进行乙醇-硫酸铵较优配比的探究.在分成两相的乙醇体积分数区间取整数体积比以方便实验研究,因此乙醇体积分数范围为20%～50%,取体积分数20%,30%,40%,50%,硫酸铵以0.1 g/mL作为最小单位分组,共分为6组,0.2～0.7 g/mL.根据上述条件进行实验,所得双水相上层液体体积与乙醇的体积分数和硫酸铵添加量关系如表1.

表1　乙醇体积分数和硫酸铵添加量对双水相上层液体体积的影响Tab.1　Effect of ammonium sulfate dosage and alcohol concen-tration on top phase volume of aqueous two-phase___

从表1可得,乙醇体积分数为30%时,硫酸铵添加量为0.3～0.5 g/mL时,上层液体体积近似于溶液中的乙醇体积,列入以下实验考虑中,而硫酸铵的添加量需进一步实验确定.乙醇体积分数在40%和50%时,恰恰与20%乙醇双水相呈现相反现象,综合考察双水相系线原则、萃取时操作方便、萃取率等因素[10],确定乙醇体积分数为30%时,萃取效果较佳,且理想硫酸铵添加量考虑范围为0.3～0.5 g/mL.

2.1.2最佳硫酸铵浓度的确定

根据上述实验结果,乙醇体积分数选定为30%,硫酸铵添加范围为0.3～0.5 g/mL,以0.02 g/mL作为最小单位,进行细化实验,结果如图2.

图2　硫酸铵添加量对30%乙醇上层液体体积的影响Fig.2　Effect of ammonium sulfate dosage on top phase volume of aqueous two-phase including 30%ethanol

从图2可得,当硫酸铵添加量在0.38～0.39 g/mL与添加量在0.42～0.44 g/mL时最接近双水相中真实乙醇含量.

2.2　苦荞麦粉中黄酮类化合物提取的单因素实验

2.2.1微波提取时间对黄酮提取率的影响

在其他因素相同的条件下,改变微波提取时间,考察其对实验结果的影响.双水相体系溶剂为φ(乙醇)30%,苦荞麦粉在提取溶剂中的质量浓度0.025 g/mL,微波功率500 W,微波时间为30～150 s(以30 s为一个单位),最高温度65℃(温度过高时,仪器自动降低微波功率,使之不超过设置值)的条件下,进行微波辅助提取操作,后添加0.38 g/mL硫酸铵溶液进行分相,最后计算苦荞麦粉的黄酮得率,如图3.

图3　微波时间对黄酮得率的影响Fig.3　Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

从图3可知,苦荞麦麦粉微波时间在50～70 s有一个峰值,并且峰值靠近60 s数据点,而对于K值最大点,考虑最大得率和最经济两种情况兼顾,故在以下细化实验中,微波时间的考虑范围均为40～80 s.

2.2.2微波功率对黄酮提取率的影响

双水相体系,溶剂为30%乙醇,苦荞麦粉在提取溶剂中的质量浓度0.025 g/mL,微波功率分别为,300～700 W(每100 W为一个单位)微波提取时间80 s,最高温度65℃的条件下,进行微波辅助萃取操作,然后添加硫酸铵进行分相,最后用酶标仪测吸光度,计算黄酮得率,数据如图4.

图4　微波功率对黄酮得率的影响Fig.4　Effect of microwave power on the extraction yield of total flavonoids

由图4可知,微波功率对于苦荞麦麦粉的影响较大,微波功率在500～600 W有一个峰值,并且峰值靠近500 W数据点,而且经过500 W这个数据点后,苦荞麦黄酮的得率有明显下降,微波功率从400～500 W,总黄酮得率有明显的升高,在进一步的细化实验中,微波功率选择从450～550 W.

2.2.3料液比对黄酮提取率的影响

双水相体系,溶剂为30%乙醇,料液比(苦荞麦粉的质量与作为浸提液溶剂的体积比,g/mL)从1∶30到1∶70,微波功率为 500 W,微波时间 60 s,最高温度65℃的条件下进行微波辅助提取,后添加硫酸铵进行分相,最后用酶标仪测吸光度并计算黄酮得率,实验结果如图5.

从图5可以看出针对苦荞麦粉中提取苦荞麦黄酮得率最高点位于料液比1∶60(g/mL)数据点左右,当料液比超过1∶50(g/mL)后,苦荞麦黄酮的得率变化不大,而当料液比高于1∶70(g/mL)时,提取就会变得相对不经济.针对这种情况,考察酶标仪测得的苦荞麦粉提取黄酮类化合物吸光度与料液比之间的关系,并作图6.

图5　料液比对黄酮得率的影响Fig.5　Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

图6 料液比对吸光度的影响Fig.6　Effect of material-to-liquid ratio on absorbance

图6表明,当料液比从 1∶30 ～1∶50(g/mL)时,溶剂利用度较高,而考虑到当料液比为1∶50～1∶60(g/mL)时得率最高,为避免资源浪费,在后续细化实验中料液比拟定为1∶30～1∶50(g/mL).

2.3　苦荞麦粉黄酮提取的响应曲面优化试验

2.3.1响应面试验设计

田志芳一个人在地窝子里，看看头顶，看看脚下，一屁股坐在土台上，叹口气，心想姆妈拼死阻拦都没拦住她和哥哥，现在怪谁呢，自己跳起脚要支边。她垂下头，把手中的沙枣花捧起来瞧，带沙点的叶根处，确实有细小的花苞，同样泛出密密麻麻的沙尘，形如青色的米粒，一粒一粒挤在一起，好似家乡中秋的桂花。猜想，沙枣花开了，是不是真有桂花那样的千里香？

在单因素实验基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,选择微波功率(A)、提取时间(B)、料液比(C)进行三因素三水平的响应面分析,确定苦荞麦粉黄酮提取的较优条件,试验因素水平组合见表2,Box-Behnken设计和结果见表3和表4.

表2　响应面优化试验因素水平表Tab.2　Factors and levels of response surface analysis

表3　Box-Behnken设计和结果Tab.3　Box-Behnken design and results

采用Design-Expert 7软件对数据进行统计分析,得到苦荞麦粉黄酮提取率对A微波功率(W)、B提取时间(s)、C料液比(g/mL)的二次多项回归方程为:

表4　回归模型的方差分析Tab.4　Variance analysis for established regression model

如表4,通过方差分析,回归模型极显著分析,除了AB和BC交互项之外,其他各项对结果的影响均达到显著水平,失拟值不显著,模型的 R2=0.969 3说明模型与实际的试验结果的拟合程度较好,可以用此模型对苦荞麦粉中的黄酮提取率进行预测.

2.3.2响应面分析

对微波功率、提取时间、料液比三因素交互作用,做响应曲面图,见图7.

图7　各因素交互作用对总黄酮得率影响的响应曲面和等高线Fig.7　Response surface plots and contour plots showing effects of pairwise interactions of factors on extraction yield of total flavonoids

从图7中可以看出,微波提取时间与料液比相互作用对苦荞麦粉黄酮提取率的影响不明显,等势面接近于圆形,微波提取时间与微波功率相互作用对苦荞麦粉黄酮提取率的影响也不明显,等势面亦接近于圆形,而料液比与微波功率相互作用对苦荞麦粉黄酮提取率的影响十分明显,等势面是明显的椭圆形.根据回归方程及上述分析,响应面存在最大值,解方程可得苦荞麦粉中黄酮的较优提取条件为微波功率534.73 W,处理时间为71.34 s,料液比为1∶48.79(g/mL),理论最大萃取得率为14.18 mg/g.考虑实际操作,取微波功率550 W,处理时间为70 s,料液比为1∶50(g/mL),三次重复实验结果平均值为13.82 mg/g,基本与预测值相近.由此可见,该模型能够较为准确地反映出三种因素对于苦荞麦粉中的黄酮提取率的影响.

3　结 论

利用乙醇-硫酸铵双水相微波辅助提取苦荞麦粉中黄酮类化合物的较优条件为萃取剂是体积分数为30%的乙醇溶液,微波功率550 W,微波提取时间70 s,料液比为1∶50(g/mL),苦荞麦粉中黄酮类化合物提取率为13.82 mg/g.而苦荞麦粉中苦荞麦黄酮含量约占总重量的2.31%[11],利用乙醇-硫酸铵双水相微波辅助提取苦荞麦粉中黄酮的得率约为1.38%,占总黄酮量的59.7%,得率较高,操作不复杂,用时较短,具有较强的可操作性.由此可得乙醇-硫酸铵双水相微波辅助提取适合于苦荞麦粉中黄酮类化合物的提取.