刘凤娇,李顺兴, ,郑凤英, ,黄旭光, ,李艳彩, ,宋 钰,吴 衍,陈妹贞

(1.南师范大学 化学与环境学院,福建 漳州 363000;2.现代分离分析科学与技术福建省重点实验室,福建 漳州 363000)

目前,海洋石油烃污染越来越严重,污染源主要包括海上作业、陆地、大气的人为源排放以及自然界排放。石油泄漏事故在世界各地频发,据估算,全球每年泄漏到大海的石油总量超过1 300 000 t[1-2]。石油烃会通过海洋食物链富集,生物体,特别是海洋食品,累积浓度超过健康标准,给人类带来健康威胁[3-4]。海洋浮游植物生长受石油烃(如0号柴油、萘、1,2,4-三甲苯、氧甲酚、邻甲苯胺)的影响[5-6]。

土霉素(OTC)是四环素类抗生素,成本低,效力高,广泛用于海水养殖中细菌性疾病的治疗[7-9]。抗生素仅 20%～30%被鱼类吸收,70%～80%进入水环境[10-11]。链霉素影响淡水浮游藻类小球藻(Chlorella vulgaris)和铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长已被证实[12]。

河口和近岸海域富营养化(即氮和磷浓度超标)已成为严重的环境问题[13-14]。海洋生物吸收氮磷遵循Redifield比例 [即n (N)︰n (P)= 16][15]。富营养化显著影响海洋浮游生物的生长、细胞形状、细胞干质量和生化组成 (如碳水化合物、蛋白质、叶绿素和碱性功能团)[13,16]。丙二醛(MDA)具细胞毒性,是脂质过氧化反应的终产物之一,也是自由基产生以及组织损伤程度的指示物[17-18]。超氧化物歧化酶(SOD)是含金属元素的活性蛋白酶,对于活性氧(含超氧阴离子O2−、过氧化氢H2O2、羟基自由基·OH、单线性氧1O2)的歧化作用起催化作用,可为需氧有机体的生存提供保护[18-19]。 氮、磷、石油烃及抗生素等近海常见污染物对自由基的形成、海洋藻体抗自由基机制的研究,迄今未见报道。

威氏海链藻是海洋硅藻的模式种之一、优良的开口饵料[20]。作者对比研究了硝酸盐、土霉素和 0号柴油浓度对威氏海链藻生长及生化组成(叶绿素a、蛋白质、MDA含量和SOD活性)的影响,为近海污染物对海洋浮游植物的毒性评价研究提供前期背景数据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

UV-75602PCS紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司);双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司);SPX-300 IC 微电脑人工气候箱(上海博迅实业有限公司);DM LB2生物显威镜(德国,Leica仪器公司);蠕动泵驱动器 Yz2515x(保定兰格恒流泵有限公司);Milli-Q净水器(美国,Millipore公司);布莱森-102C超声波破碎仪(中国布莱森超声波公司)。

1.2 实验药品

硝酸钾配制N标准储备液(10 mmol/L);磷酸二氢钾配制 P标准储备液(360 mmol/L);氯化铵溶液(4.67 mol/L);No.0柴油储备液100 mg/L(No.0柴油,购于中国石化加油站);土霉素(0.25 g/片,江西国药有限责任公司);实验用去离子水由 Milli-Q离子交换净水系统处理(电阻率 18 MΩcm)。溶液均用去离子水配制。

1.3 藻类培养条件

海水取自东海外海,用0.2 μm滤膜过滤,于4℃下保存 6个月。用铜镉柱还原法[21]和抗坏血酸还原磷钼蓝法[22]测海水中氮、磷含量,平行测定3次,得海水中氮、磷的背景值分别为1.2、0.2 μmol/L。

威氏海链藻来自厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室,保存于海水中(添加 Na2SiO3·H2O 保持 Si浓度为21.1 mmol/L)。实验过程中海水P浓度保持在1.0 μmol/L,c(N)分别为 8.0,16.0,32.0,64.0 μmol/L、c(WAFs)分别为 0.1,0.5,1.0,5.0 mg/L、c(OTC)分别为 1.0,3.0,5.0,10.0 mg/L。光照强度 140 μmol/(m2s);光暗比14 h︰10 h;水温19℃。适当搅拌(100 r/min)海藻悬浮液,模拟海水流动,同时减少WAFs和OTC在容器壁上的吸附。生物平行样重复测定 3次。每24 h监测培养液中 N、P浓度,适时补充 KNO3和KH2PO4,保持氮磷的浓度和比值不变。

1.4 参数测定方法

显微镜计数法测定培养后海藻细胞的藻密度。取藻液100 mL,用0.2 μm滤膜过滤,在暗处冷冻条件下用5 mL 90%丙酮萃取10 h,离心(4 000 r/min)10 min。取上清液,分别在 λ663、λ645、λ630、λ750处测定吸光值,用 λ663、λ645、λ630的吸光值减去 λ750的吸光值,以校正微粒浊度空白的吸光度,将所得数据参照文献[23]计算叶绿素a含量。

取藻液800 mL,用0.2 μm滤膜过滤,于藻体中加入5 mL磷酸缓冲液(预冷,0.1 mol/L,pH=7.8),在冰浴中用超声波破碎仪破碎 30 min,匀浆液离心(10 000 r/min)10 min,上清液为粗酶液,采用氮蓝四唑光化学还原反应法[24]测SOD活性,硫代巴比妥酸(TBA)法[25]测定MDA含量,考马斯亮蓝法[26]测蛋白质含量。

2 结果与讨论

2.1 近海污染物对威氏海链藻生长的影响

细胞增长率取决于细胞分裂率。以东海外海海水(c(N)= 1.2 μmol/L,c(P)=0.2 μmol/L)为对照组,据图1～图3所示,N、OTC和WAFs均对威氏海链藻的生长产生不同程度的影响。添加 OTC,在整个生长周期,藻细胞密度均高于对照组,即起促进作用;添加N,在指数期,藻的生长状况优于对照组,N起促进效应,在稳定期,却呈反作用;添加 WAFs,在适应期,有利于藻生长,指数期之后,抑制藻生长。当c(N)、c(OTC)、c(WAFs)分别为 8.0～32.0 μmol/L,1.0～5.0 mg/L,0.1～0.5 mg/L时,细胞密度随浓度增加而增加;当 c(N)、c(OTC)、c(WAFs)分别为 64.0 μmol/L、10.0 mg/L、5.0 mg/L时,细胞生长受抑制。.

图1 硝酸盐添加对威氏海链藻细胞密度的影响Fig.1 Influence of N addition on the cell density of T.weissflogii

图2 0号柴油分散液添加对威氏海链藻细胞密度的影响Fig.2 Influence of water accommodated fractions of No.0 diesel oil on the cell density of T.weissflogii c(N)=1.2 μmol/L,c( P)=0.2 μmol/L

图3 土霉素添加对威氏海链藻细胞密度的影响Fig.3 Influence of OTC addition on the cell density of T.weissflogii (n (N)︰n (P)=1.2︰0.2)

添加 WAFs,细胞密度最高值与对照组相比明显减少,当剂量为5.0 mg/L时,细胞密度仅为对照组的0.3倍。OTC能促进细胞生长,浓度5.0 mg/L作用最大,是对照组的 1.4倍。3种污染物对藻细胞生长毒性影响程度为: WAFs＞N＞OTC,即3者对纺锤体的形成影响不同。3种污染物均使藻的生长周期缩短,除5.0 mg/L WAFs缩短5 d,其他条件下缩短 2～3 d。

2.2 近海污染物对叶绿素a含量的影响

叶绿素是浮游植物进行光合作用的重要物质,叶绿素 a含量可用来估算初级生产力,也是浮游植物生命力的重要表征。叶绿素a是一种色素-蛋白质复合体,氮是其合成的主要合成原料,当培养介质中N缺乏,必然限制藻体中叶绿素a的合成[15]。实验探究不同浓度N、OTC和WAFs对叶绿素a 含量的影响如图4所示。

图4 硝酸盐、土霉素及0号柴油分散液添加对叶绿素a含量的影响Fig.4 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of chlorophyll a

当c(N)低于8.0 μmol/L,即氮相对不足,叶绿素a合成受限,叶绿素a 含量最低;当c(N)为32.0 μmol/L时,威氏海链藻处于最佳生长状况,叶绿素 a 含量最高;当c(N)高于32.0 μmol/L时,威氏海链藻生长受抑制,对叶绿素合成不利。上述影响与营养盐浓度对细胞生长和生化组成的影响类似[18]。c(OTC)为1.0～5.0 mg/L能促进藻生长,但浓度为10.0 mg/L抑制藻生长,从而影响藻体中叶绿素a合成。浮游植物能降解石油烃,通过同化作用将 0.1～1.0 mg/L的WAFs做为营养源,促进自身生长,但石油烃浓度过大(5.0 mg/L),影响光合作用和呼吸作用,抑制叶绿素a合成。

3种污染物对叶绿素 a合成影响程度为 N＞OTC＞WAFs,此结果证明 N是叶绿素合成的主要限制因素之一、叶绿素合成与藻的生长状态密切相关。

2.3 近海污染物对蛋白质含量的影响

N是生理过程的主要参与者,对蛋白质积累和合成起关键作用。蛋白质主要是N同化作用产物,其浓度可作为新陈代谢能力和能源供应条件的指示物。硝酸还原酶是NO3-N转为NH4+N过程中的速率控制酶[27]。谷氨酰胺合成酶是影响蛋白质结构的关键酶,可增强N活性,有利于同化作用,从而促进蛋白质合成。

图5所示,c(N)=16.0 μmol/L时,藻生长状况最佳,蛋白质含量最高;c(N)＜16.0 μmol/L 时,藻细胞密度增幅较小且提前进入衰亡期,N成为限制因子,没有足够 N供蛋白质合成之用,藻体中硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶活性降低,N吸收和同化效率降低;在c(N)＞16.0 μmol/L时,随着N浓度增加蛋白质合成受抑制,可能是 N过量诱发羟基自由基过量,抑制硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶活性[27]。当c(OTC)、c(WAFs)分别为 1.0～3.0 mg/L、0.1～1.0 mg/L 时,蛋白质含量随其浓度增加而增加;当c(OTC)＞3.0 mg/L、c(WAFs)＞1.0 mg/L时,蛋白质含量随之降低,这归因于OTC和WAFs含量过高致使细胞提前进入衰亡期,硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶活性下降。

图5 硝酸盐、土霉素及0号柴油分散液添加对蛋白质含量的影响Fig.5 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of protein

3种污染物对蛋白质合成的影响程度为N＞WAFs＞OTC,因为N浓度控制着蛋白质合成和藻的生长状态,过量的 N和 WAFs可促进羟基自由基的产生[27],从而影响硝酸还原酶及谷氨酰胺合成酶活性而使蛋白质合成受抑制。

2.4 近海污染物对SOD活性的影响

浮游植物可通过抗氧化酶系统(如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶)的协同作用保护机体[26],过量活性氧类物质会破坏脂质膜、蛋白质、色素、核酸,致生产力严重下降,甚至使之死亡[24]。SOD活性与活性氧物质数量有关。营养盐N的光解作用和海洋浮游植物的光化学反应均会产生·OH[29],藻细胞的生化组成会影响其光化学活性,因此,SOD活性受N、OTC和WAFs的影响,具体情况见图6。

图6 硝酸盐、土霉素及0号柴油分散液添加对SOD酶活性的影响Fig.6 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the activity of SOD

当c(N)低于32.0 μmol/L时,N浓度较低,藻生长状况较差,藻细胞抗氧化能力较弱,故 SOD活性较低;当 c(N)为 32.0 μmol/L时,藻生长状况最佳,抗氧化能力增强,SOD活性最高;当c(N)超过32.0 μmol/L时,N 的光解作用诱发产生大量·OH,抑制 SOD 活性。实验结果证明海水中·OH的产生受N影响[28,30]。SOD 活性与藻类生长状况密切相关,当 c(OTC)和c(WAFs)分别为 1.0～5.0 mg/L 和 0.1～0.5 mg/L 时,SOD 酶活性随浓度增大而逐渐增加;当 c(OTC)和c(WAFs)分别超过3.0 mg/L和0.5 mg/L时,SOD活性随浓度增大而降低,说明藻细胞进入衰老期,抗氧化能力减弱。

3种污染物对藻细胞抗氧化能力(即 SOD活性)的影响程度为: WAFs＞N＞OTC,与对藻生长(即藻细胞密度)的影响一致。

2.5 近海污染物对MDA含量的影响

不同浓度N、OTC和WAFs对MDA含量的影响如图7。N、OTC和WAFs的毒性效应可能源自过量自由基的危害。N、OTC和 WAFs可促进 O2−、H2O2、·OH和1O2生成[3,12,28],致机体受到多种损害。

图7 硝酸盐、土霉素及0号柴油分散液添加对MDA含量的影响Fig.7 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of MDA

当c(N)= 8.0 μmol/L时,叶绿素和蛋白质合成受限,活性氧过量积累,致脂质过氧化反应加强,MDA含量最大;当 c(N)= 32.0 μmol/L时,藻处最佳生长状况,生命力最强,脂质过氧化程度低,MDA浓度最低。当 c(OTC)和c(WAFs)分别为1.0～5.0 mg/L和0.1～0.5 mg/L时,可促进藻细胞新陈代谢、叶绿素及蛋白质合成,可减少脂质过氧化,MDA含量随之降低;当 c(N)＞32.0 μmol/L,c(OTC)和 c(WAFs)分别为10.0 mg/L和0.5 mg/L时,脂质过氧化作用增强,使得藻细胞提前进入衰亡期,MDA含量增加。

3种污染物对藻细胞脂质过氧化(即MDA含量)的影响程度为OTC≫N ＞WAFs.

3 结论

当 N、OTC、WAFs浓度分别为 8.0～32.0 μmol/L,1.0～5.0 mg/L,0.1～0.5 mg/L时,威氏海链藻的细胞浓度、SOD活性、叶绿素a和蛋白质含量随之增加而增加,MDA浓度随之增大而减少;当N、OTC、WAFs浓度分别大于32.0 μmol/L,5.0 mg/ L和0.5 mg/L时,影响趋势与上述情况相反,即藻生长及SOD活性受抑制,叶绿素和蛋白质含量降低,MDA浓度增加。

氮营养盐、抗生素、石油烃对藻生长(即藻细胞密度)、叶绿素a合成、蛋白质生成、藻细胞抗氧化能力(即超氧化物歧化酶活性)、脂质过氧化(即丙二醛含量)的影响程度分别为 WAFs＞N＞OTC、N＞OTC＞WAFs、N＞WAFs＞OTC、WAFs＞N＞OTC、OTC≫N＞WAFs。影响程度的差异,揭示近海各污染物的毒性作用机制及靶位不同。

氮营养盐、抗生素、石油烃污染影响海洋浮游植物的生长和生化组成,而海洋浮游植物是海洋的初级生产力,故海洋的食物链稳定和食物链中能量的传递会受近海污染物影响。

[1]Rodrigues R V,Miranda-Filho K C,Gusmão E P,et al.Deleterious effects of water-soluble fraction of petroleum,diesel and gasoline on marine pejerrey odontesthes argentinensis larvae[J].Science of the Total Environment,2010,408: 2054-2059.

[2]Harris K A,Yunker M B,Dangerfield N,et al.Sediment-associated aliphatic and aromatic hydrocarbons in coastal British Columbia,Canada: Concentrations,composition,and associated risks to protected sea otters[J].Environmental Pollution,2011,159: 2665-2674.

[3]Luo X J,Chen S J,Mai B X,et al.Polycyclic aromatic hydrocarbons in suspended particulate matter and sediments from the Pearl River Estuary and adjacent coastal areas[J].Environmental Pollution,2006,139: 9-20.

[4]EPA (Environmental Protection Agency).Petroleum hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons differ in their potential for vapor intrusion[J].Environmental Science and Technology,2011,41: 3241-3248.

[5]Lee M Y,Nicol J A C.Individual and combined toxicity of some petroleum aromatics to the marine amphipod elasmopus pectenicrus [J].Marine Biology,1978,48: 215-222.

[6]李克强,王修林,祝陈坚,等.No.0柴油水溶组分海洋浮游植物生态效应研究 [J].环境科学,2007,28: 304-308.

[7]Miranda C D,Zemelmen R.Bacterial resistence to OTC in Chilean salmon farming[J].Aquaculture,2002,212: 31-47.

[8]Rigos G,Nengas I,Tyrpenou A E,et al.Pharmacokinetics and bioavailability of OTC in gilthead sea bream (Sparus aurata)after a single dose[J].Aquaculture,2003,221: 75-83.

[9]Fritz J,Zuo Y G.Simultaneous determination of tetracycline,oxytetracycline,and 4-Epitetracycline in milk by high-performance liquid chromatography[J].Food Chemistry,2007,105: 1297-1301.

[10]Samuelsen O B.Degradation of seawater at two water temperatures and light intensities,and the persistence of OTC in the sediment from a fish farm[J].Aquaculture,1989,83: 7-16.

[11]Elema M O,Hoff K A,Kristensen H G.Bioavailability of OTC from medicated feed administered to Atlantic salmon (Salmo salar L.)in seawater[J].Aquaculture,1996,143: 7-14.

[12]Qian H F,Li J J,Pan X J,et al.Effects of streptomycin on growth of algae Chlorella vulgaris and Microcystis aeruginosa [J].Environment Toxicology,2010,doi: 10.1002/tox.20636.

[13]Kucuksezgin F,Kontas A,Altay O,et al.Assessment of marine pollution in Izmir Bay: Nutrient,heavy metal and total hydrocarbon concentrations[J].Environment Internation,2006,32: 41-51.

[14]Bizsel N,Uslu O,Phosphate,nitrogen and iron enrichment in the polluted Izmir Bay,Aegean Sea[J].Marine Environmental Research,2000,49: 101-122.

[15]李顺兴,郑凤英,洪华生,等.氮磷营养盐对微氏海链藻细胞生化组成的影响[J].海洋科学,2006,30: 49-53.

[16]Li S X,Hong H S,Zheng F Y,et al.Influence of nitrate on metal sorption and bioaccumulation in marine phytoplankton,Dunaliella salina[J].Environmental Toxicology,2007,122: 582-586.

[17]Ohkawa,Ohishi N,Yagi K.Assay for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction [J].Analysis Biochemistry,1979,95: 351-358.

[18]Meenakshi C,Umesh K J,Mohammed A K,et al.Effect of heavy metal stress on proline,malondialdehyde,and superoxide dismutase activity in the cyanobacterium Spirulina platensis-S5[J].Ecotoxicology and Environment Safety,2007,66: 204-209.

[19]Beyer J I,Fridovich I.Superoxide dismutase progress in nucleic acids[J].Nucleic Acids Research,1991,40: 221-253.

[20]朱明,张学成,茅云翔,等.温度、盐度及光照强度对海链藻 (Thalassiosira weissflogii)生长的影响[J].海洋科学,2003,27(12): 58-61.

[21]Thabano J R E,Abong’o D,Sawula G M.Determination of nitrate by suppressed ion chromatography after copperised-cadmium column reduction[J].Journal of Chromatography A,2004,1045: 153-159.

[22]Shyla B,Mahadevaiah,Nagendrappa G.A simple spectrophotometric method for the determination of phosphate in soil,detergents,water,bone and food samples through the formation of phosphomolybdate complex followed by its reduction with thiourea[J].Spectrochimica Acta part A,2011,78: 497-502.

[23]戴荣继,黄春,佟斌,等.藻类叶绿素及其降解产物的测定方法[J].中央民族大学学报(自然科学版),2004,13: 75-80.

[24]Hara P M,Irwin Fridovich.Superoxide dismutase: A photochemical augmentation assay[J].Archives of Biochemistry Biophysics,1977,181: 308-312.

[25]Sofia E C,Anatoly K Y.Cyclodextrin enhanced fluorimetric determination of malonaldehyde by the thiobarbituric acid method [J].Talanta,1997,44: 951-957.

[26]Li Y S,Ge Y S,Zhang Y,et al.Interaction of coomassie brilliant blue G250 with human serum albumin:probing of the binding mechanism and binding site by spectroscopic and molecular modeling methods[J].Journal of Molecular Structure,2010,968: 24-31.

[27]Csiszár J,Lantos E,Tari I,et al.Antioxidant enzyme activities in allium species and their cultivars under water stress[J].Plant Soil Environment,2007,53: 517–523.

[28]Li S X,Hong H S,Zheng F Y,et al.Photoproduction of hydroxyl radical in seawater with marine alga (Dunaliella salina)influenced by both metal pollution and macronutrient enrichment[J].Marine Chemistry,2008,108: 207-214.

[29]Li S X,Hong H S,Zheng F Y,et al.Effects of metal pollution and macronutrient enrichment on the photoproduction of hydroxyl radicals in seawater by the alga Dunaliella salina [J].Marine Chemistry,2008,108: 207-214.

[30]杨美英,赵洪锟,蒋春玲,等.不同蛋白含量大豆品种氮代谢关键酶活性及叶片氮同化物含量变化[J].中国油料作物学报,2010,32: 500-505.