陈 孜，徐又佳，李光飞，张 鹏，沈光思

(1.苏州大学附属第二医院骨科，江苏苏州 215004；2.南京大学附属常州第二医院骨科，江苏常州 213000)

◇技术方法研究◇

SELEX筛选骨肉瘤HER2适配体方法的建立

陈 孜1，2，徐又佳1，李光飞1，张 鹏1，沈光思1

(1.苏州大学附属第二医院骨科，江苏苏州 215004；2.南京大学附属常州第二医院骨科，江苏常州 213000)

目的应用SELEX(system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与HER2特异性结合的寡聚核酸适配体(aptamer)。方法体外合成了长度为78个碱基并含有35个随机寡核苷酸的ssDNA文库，通过生物素-链亲和素磁珠系统分离法制备次级ssDNA文库，且经以微孔为介质的SELEX正反筛法获得了与HER2特异性结合的DNA适配体；同时利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮ssDNA与靶蛋白HER2的亲和力，将亲和力最高的适配体群进行克隆、测序。最后利用生物学软件DNAMAN对适配体群进行了一级结构和二级结构的分析，同时将亲和性最高的适配体做了进一步的特异性的检验。结果经过12轮的筛选，获得了与HER2蛋白具有极高亲和力的适配体9号，亲和力从初始的0.18上升至0.86，提高了约5倍。特异性结果显示，9号适配体只与HER2具有较高的特异性。结论经过多轮的筛选，成功获得了特异性识别骨肉瘤HER2蛋白的单链DNA适配体，为骨肉瘤的诊断和治疗奠定了基础。

SELEX技术；骨肉瘤；HER2；DNA适配体

骨肉瘤是好发于青少年的骨原发性恶性肿瘤，5年生存率低，是严重影响青壮年健康的恶性肿瘤之一。因此，早期诊断对骨肉瘤的治疗及预后至关重要。近些年来，由于应用保肢手术、化疗、热疗及免疫治疗等复合治疗，使得骨肉瘤患者的5年存活率提高到70%左右［1］。尽管如此，仍有30%～40%的患者发生肿瘤转移，这些患者中的大部分对于保肢治疗无效、预后差［2］。如果用一种精确的分子诊断标记物作为一种判断指标，将对骨肉瘤的早期诊断和预后都是非常有用的。

HER2是骨肉瘤的分子诊断标记物之一，是由癌基因erbB-2/编码的分子质量为185 ku、且功能类似于一种生长因子受体样的跨膜糖蛋白，因其能过度传导生长信号，所以导致细胞恶性增殖［3］。恶性程度越高，越容易复发和转移，且对预后的判断就越差。因此，针对HER2的靶向治疗在医学上有着重大的意义。

目前，在疾病的早期诊断中对分子标记物的方法主要有：PCR、荧光定量、免疫荧光、ELISA等方法来检测样品中靶蛋白的存在。近年来，适配体(aptamer)替代抗体已在蛋白质检测上得到广泛应用。适配体是通过SELEX技术从人工合成的寡核苷酸文库中筛选出来的，与非核酸靶物质特异结合的高亲和性单链寡核苷酸序列。而SELEX技术是利用分子生物学技术，将随机寡核苷酸文库与靶物质相互作用，保留结合的寡核苷酸序列，经反复扩增、筛选，使与该靶物质特异结合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX技术已经被成功的应用于很多领域，但以骨肉瘤HER2为靶分子作为研究对象，尚未见报道。本文旨在用SELEX技术筛选出与HER2特异性结合的适配体，为骨肉瘤的早期诊断和预后判断提供了一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料HER2重组蛋白(8 mg/m L)由西安晶彩生物科技有限公司提供；ssDNA文库，引物均参照文献［4］的方法：中间为35个碱基的随机序列，两端为固定序列(5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3')；PCR扩增所用引物由引物软件Primer5.0设计，无标记的上游引物(A1)：5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3'，无标记的下游引物(A2)：5'-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'，下游5'标记有生物素(A3)：5'-生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'，均由北京华大基因研究中心合成；链亲和素磁珠购自Promega公司；异硫氰酸胍购自GIBCO公司；酵母tRNA、BSA、p GM-T克隆试剂盒、HRP-labeled Streptavidin和TMB显色液均由晶彩生物提供。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞系及培养体外培养人骨肉瘤细胞系mg-63和人成骨细胞系hFOB1.19(第四军医大学细胞中心)，用DMEM培养基(含100 m L/L的胎牛血清)，在37℃孵育箱中培养。

1.3 方法

1.3.1 生物素-链亲素磁珠分离制备次级ssDNA文库 在PCR的反应中，以ssDNA文库为模板，利用A3引物扩增出3'端带有生物素的dsDNA文库，将纯化后的dsDNA产物，与链亲和素磁珠结合，以生物素为介质会将dsDNA与磁珠上的链亲和素结合，后用0.15 mol/L的NaOH使dsDNA变性解链，用生物素标记的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，而解离下来的是一条不带生物素的核酸链，经乙醇沉淀后，溶于TE中，测定吸光值，作为次级ssDNA文库［］。

1.3.2 利用以微孔为介质的筛选方法筛选与HER2蛋白结合的适配体 参考文献［6］的方法，用包被液为0.05 mol/L的Na HCO3，p H 9.6的缓冲液将骨肉瘤HER2蛋白包被于96孔酶联板上，于4℃过夜，同时以空白孔作为对照组，用0.3 g/L牛血清白蛋白(BSA)封闭液将HER2包被孔和空白孔于37℃封闭2 h。将体外合成的ssDNA文库在结合液SHCMK (20 mmol/L Hepes p H 7.35、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2)中与空白对照孔于37℃结合40～60 min，同时在结合液中加入酵母t RNA竞争试剂，提高适配体的特异性。利用反筛法除去与BSA和微孔结合的ssDNA，然后转移到骨肉瘤HER2蛋白包被孔中与HER2蛋白于37℃结合40～60 min，用洗涤液(含有0.05% SHCMK)洗涤4～6次，除去未结合的ssDNA，最后加洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl、4 mmol/L异硫氰酸胍、1 mmol/L DTT，p H 8.3)在80℃作用10～15 min，洗脱下与HER2蛋白结合的ssDNA，经苯酚-氯仿法抽提，乙醇沉淀将ssDNA分离出，再以此为模板用A3引物经PCR扩增获得带有生物素标记的dsDNA文库，进一步用生物素-链亲和素磁珠分离ssDNA，作为次级ssDNA文库。

1.3.3 次级ssDNA文库亲和力的检测 将纯化获得的ssDNA文库，采用生物素标记的A3引物扩增获得5'端标记了生物素的ssDNA文库。利用以微孔为介质的筛选过程设置空白对照孔和蛋白包被孔，然后加入各轮标记有生物素的ssDNA文库孵育，然后加入1∶1 000稀释的HRP-labeled Streptavidin于37℃孵育20～30 min，最后加入TMB显色液200 μL，室温避光显色15 min，加入2 mol/L H2SO4450 μL终止反应，5 min内于酶标仪中测定A450nm。

1.3.4 筛选产物的克隆、测序、分析 利用对称PCR的方法将筛选克隆到的ssDNA产物扩增成无标记的dsDNA，将其纯化后TA克隆到p GM-T载体上，转化后任意挑取25个克隆进行菌落PCR的鉴定，将鉴定成功的阳性菌液送华大基因研究中心进行测序，利用生物软件DNAMAN对测序后的结果进行一级和二级结构分析。

1.3.5 适配体亲和力的检测 随意提取适配体群中8个含有相应适配体序列的质粒，以此为模板，采用生物素标记的A3引物分别扩增获得8个5'端标记了生物素的适配体ssDNA序列。按第1.3.3节亲和力检测的方法测定各适配体的A450nm值。

1.3.6 适配体特异性的检测 按照1.3.3的方法来检测亲和性最高的适配体与骨肉瘤细胞中HER2蛋白的特异性，实验重复3次且分为以下5组：适配体9号分别与正常细胞、骨肉瘤细胞、牛血清白蛋白、脱脂奶粉进行结合反应测定其特异性，其中空白对照只加适配体，不加其他任何物质。

2 结 果

2.1 PCR扩增条件的优化在PCR扩增反应中，为了提高DNA的纯度和产量，对其退火温度和循环次数都进行了摸索，经10 g/L的琼脂糖电泳检测。结果显示，退火温度为60℃时，其条带较亮且特异性较好(图1)。当退火温度一定时，分别进行了12、16、20、24、30、40个循环的PCR，经浓度为100 g/L SDSPAGE电泳分析，结果显示，PCR为24个循环时可以扩增到相对大量且特异的ssDNA，随着循环数的增加，引物浓度不断的降低，从第30个循环之后条带出现了弥散状态，非特异性增多(图2)。

图1 PCR反应退火温度的优化Fig.1 The dsDNA products by PCR at different annealing temperature

2.2 各轮次级文库ssDNA亲和力的检测经SELEX技术的反复筛选，利用生物素-辣根过氧化物酶-链霉亲和素系统检测每各轮次级文库ssDNA文库与HER2多肽的亲和力。结果显示，亲和力在第12轮明显提高，之后亲和力趋于一个水平状态，因此在第14轮停止检测(图3)。

图2 PCR反应循环数的优化电泳图Fig.2 The dsDNA products by PCR at different cycles

图3 各轮次级文库ssDNA亲和力的检测Fig.3 Determination of the affinities of secondary libraries for HER2 using a biotin-strepavidin-HRP detecting system

2.3 适配体一级结构的分析将第12轮筛选的ss-DNA文库，克隆至载体PGM-T中，共挑选了25个克隆子进行测序，并对其测序结果用DNAMAN软件进行了比对分析，结果显示25个适配体并无共同的保守序列(表1)。

2.4 适配体二级结构的分析用生物学软件DNAMAN模拟了适配体的二级结构，结果显示，适配体主要由A、B、C、D四种结构形式存在，这与其具有较高的亲和性的特征是相符的。

2.5 适配体亲和力的检测从4组不同的二级结构中选取了8个适配体进行亲和力的检测，发现第2组中的9号适配体与骨肉瘤HER2蛋白亲和力最高(图4)。

2.6 测定9号适配体的特异性数据使用SPSS 17.0统计软件分析适配体与每组样品间的特异性。结果显示，9号适配体与骨肉瘤细胞的特异性显著，与正常细胞、牛血清白蛋白、脱脂奶粉的结合值及空白对照组比较无显著特异性(图5)。

表1 25个适配体的测序结果Tab.1 Sequencing Results of 25 aptamers

图4 8个适配体的亲和力测试结果Fig.4 Determination of the affinities of 8 aptamers for HER2 using a biotin-strepavidin-HRP detecting system

图5 9号适配体特异性检测结果Fig.5 Specificity of aptamer number 9

3 讨 论

SELEX筛选技术是一种从大容量的单链寡聚核苷酸库中筛选与靶蛋白高特异结合的寡聚核苷序列。由于适配体在功能上与抗体相似，且又具有比抗体优越的特性：稳定性好、可被修饰、获得周期短、且与靶蛋白特异性结合。适配体能够分辨出靶物质结构上细微的差别，甚至对一个甲基或是一个羟甲基的区别都能够辨认［7］。所以，适配体筛选技术在骨肉瘤的早期诊断和预后判断中已经越来越受到人们的青睐。在多种肿瘤组织中都存在HER2/neu基因的扩增和过表达(over express)，包括20%～30%卵巢和乳腺癌、35%～45%胰腺癌及90%的结肠直肠癌［8］、40%～44%成骨肉瘤及58%成骨肉瘤肺转移癌［9-10］、16%～57%的非小细胞肺癌［11］，已经成为一种公认的肿瘤标志物。

本研究以大分子骨肉瘤HER2蛋白为靶蛋白，筛选与之特异性结合的适配体。为提高筛选的有效性，本文从退火温度和循环数两个方面进行筛选条件的优化，得到了大量特异的次级ssDNA文库，同时为获得纯度较高的dsDNA，本文采用生物素-链亲和素磁珠分离法。在操作过程中只需保证dsDNA的量的纯度，便可获得极高纯度和足量的ssDNA。在筛选过程中靶分子和寡聚核苷酸文库浓度的比值对筛选效率有着很大的影响，对其比值进行优化，随着筛选轮数的增加，次级文库的ssDNA的量和亲和性会得到富集，这与实验中检测的亲和性提高了约5倍是相符合的。

DNAMAN软件模拟适配体的二级结构显示，其主要是以口袋和茎环的形式存在，这可能是适配体与HER2蛋白结合的基础结构。SPSS统计软件分析了9号适配体与骨肉瘤细胞的特异性显著(P＜0.05)，而对照组几乎不存在特异性。因此，可以作为一种重要的靶向分子应用于骨肉瘤的诊断和治疗中。本文筛选出的骨肉瘤HER2蛋白的适配体，为骨肉瘤早期的诊断和预后判断提供了一种新的方法，这在靶向治疗方面具有着很重要的应用潜能。

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(编辑 卓选鹏)

Establishment of screening osteosarcoma HER2 aptamer method by SELEX

CHEN Zi1，2，XU You-jia1，LI Guang-fei1，ZHANG Peng1，SHEN Guang-si1
(1.Department of Orthopedics，the Second Affiliated Hospital of SooChow University，Suzhou 215004；2.Department of Orthopedics，Changzhou No.2 Hospital of Nanjing University，Changzhou 213000，China)

ObjectiveTo screen oligo-nucleic acid aptamers with HER2-specific binding by system evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)technology.MethodsWe in vitro synthesized with a length of 78 bases containing 35 random nucleotides ssDNA library and prepared secondary separation system ssDNA library by biotin-streptavidin beads.The microporous was used as a medium to obtain with HER2-specific binding of DNA aptamers by SELEX.We detected the affinity of each round of ssDNA with the target protein HER2 using biotinstreptavidin-biotin-horseradish peroxidase system.The highest affinity aptamers group was cloned and sequenced. Finally，we analyzed the primary and the secondary structures of the aptamers group using biological software DNAMAN，and meanwhile further tested the specificity of the aptamer with the highest affinity.ResultsAfter 12 rounds of screening，we obtained aptamers that had high affinity with HER2 protein and the number was 9；the affinity increased by about 5 times from the initial 0.18 to 0.86.Specificity Results showed that number 9 aptamer had a high specificity only with HER2.ConclusionAfter several rounds of screening，we successfully obtained osteosarcoma HER2 protein specifically recognizing single-stranded DNA aptamers，which has laid a solid foundation for the diagnosis and treatment of osteosarcoma.

SELEX technology；osteosarcoma；HER2；DNA aptamer

R446.6

A

1671-8259(2014)05-0703-04

10.7652/jdyxb201405028

2013-09-10

2013-12-25

国家自然科学基金资助项目(No.81273090) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81273090)

徐又佳，教授，博士，硕士生导师.E-mail：xuyoujia@medmail.com.cn

陈孜(1972-)，男(汉族)，硕士研究生，主要从事骨肿瘤治疗.E-mail：coolcz2000@gmail.com

时间：2014-05-16 16∶06 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140524.2118.005.html