王成荣，卞廷松，丁志祥，谈小林，杨凯

(1.南京中医药大学，江苏南京210046；2.常州市中医医院男科，江苏常州213003；3.常州市中医医院检验科，江苏常州213003)

·论著·

少弱精子症患者PRM2基因mRNA表达水平的研究

王成荣1，卞廷松2，丁志祥3，谈小林2，杨凯1

(1.南京中医药大学，江苏南京210046；2.常州市中医医院男科，江苏常州213003；3.常州市中医医院检验科，江苏常州213003)

目的 探讨少弱精子症患者与正常人精液精子中PRM2基因mRNA的表达水平。方法选取少弱精子症患者20例为实验组，精子正常者10例为对照组，比较两组间精子浓度、活力和PRM2 mRNA水平的变化。结果PRM2 mRNA水平，实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；精子浓度，两组间差异有显著统计学意义(P＜0.01)；A级精子，两组间比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；A+B级精子，两组间差异有显著统计学意义(P＜0.01)；另外PRM2 mRNA水平与A级精子和A+B级之间存在正相关性(相关系数分别为0.419，0.571；P值分别为0.021，0.001)。结论少弱精子症患者其PRM2基因mRNA表达水平低于正常人，我们推测PRM2基因的mRNA的表达水平可以在一定程度上反映患者的精子质量水平，检测精子中PRM2 mRNA的表达水平能在一定程度上反映睾丸精子发生过程中的表达事件，可成为男性不育症病因研究、检测和临床治疗效果观察的一个重要指标。

少弱精子症；PRM2；mRNA

不孕不育困扰着10%～15%的育龄夫妇，且有逐年增加的趋势，其中男性因素占30%～50%[1]。男性不育问题越来越受到人们的重视。少弱精子症是临床常见的男性不育原因之一。哺乳动物精子被认为是细胞核基因转录停止的细胞，但近年的研究证实在人射出精子中存在细胞核基因组的mRNA[2]。目前对这些mRNA的来源和存在意义尚不十分清楚。有研究提示，精子中的mRNA可能有重要的功能[3-6]。PRM1几乎存在于所有的哺乳动物中，而PRM2只存在于人等一些哺乳动物中[7]，这提示PRM1可能起着基本的作用，而PRM2则起着某种特殊的作用。因此我们选取PRM2来探讨其mRNA表达水平与少弱精子症的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料根据世界卫生组织(WHO)诊断标准(1999)，选择2011年1月至2013年5月之间的少弱精子症患者20例作为实验组，年龄20～34岁。不育病史均在1年以上，女方无不孕因素。性腺轴分泌卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)及睾酮(T)水平均在正常范围，生殖器发育均正常，无其他引起男性不育的相关病史。另选取10例精子正常的男性10例作为对照组，年龄28～31岁。

1.2 材料

1.2.1 精液标本收集所有对象禁欲2～5 d，手淫法收集全程精液于无菌洁净广口杯中，置37℃恒温箱中待其液化后，依据《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》(第4版)的操作方法，进行精液常规检测，包括精液量、精子浓度、精子活力等。

1.2.2 主要试剂与仪器试剂：总RNA抽提取试剂组合(购自上海申能博彩生物科技有限公司)，FERMENTAS(K1622)反转录试剂盒(购自上海安力特生物科技有限公司)，SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(DRR820S)试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)等；仪器包括：CFT-9200型荧光精子动(静)态图像分析系统(北京航天瑞祺)，XH-B型漩涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司)，PTC-100TM型PCR仪(Programmable Thermal Controller,MJ Research Inc，美国)，ABI 7500 Real-Time PCR System.

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA的提取每份精子需要500 μl Solution D和3.6 μl β-Mercaptoethanol，在合适的容器中混合上述试剂，加入精子样品，混匀；在匀浆中加入50 μl的2 mol/L醋酸钠，混匀；加入500 μl苯酚水饱和，混匀(注意：水饱和羟基苯上有一层水相保护层，取羟基苯时，应将Tip伸到下面的有机层)；加入120 μl的氯防：异戊醇，盖紧盖子，剧烈混匀，冰上放置5 min；室温高速，12 000 r/min，离心5 min，应清晰两相，RNA在上层水相中(如没有分层，可补加少许氯仿-异戊醇，盖紧盖子，剧烈混匀，重新离心)；小心将上层水相移到RNase-free离心管中；加入500 μl异丙醇，颠倒混匀，-20℃置30 min；4℃14 000 r/min，离心15 min；弃上清，沉淀用75%乙醇洗两次；彻底去除离心管内的乙醇，室温倒置15 min干燥；沉淀用250 μl DEPC-H2O溶解。纯化出的RNA放置于-20℃保存备用。

1.3.2 第一链cDNA合成在PTC-100TM型PCR仪上使用20 μl的反应体系42℃，60 min以及70℃，5 min进行RNA的反转录，反应体系如下：总RNA 11 μl，oligo(dT)18 primer 1 μl，5X Reaction Buffer 4 μl，Ribolock RNase Inhibitor(20 U/μl)1μl，10 mmol/L dNTP Mix 2 μ l，RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase(200 U/μl)1 μl。将反转录好的产物即第一链cDNA放于-20℃保存以备用。

1.3.3 引物设计在GeneBank上查找目的基因的序列，利用Primer Premier5软件设计特异性引物。引物序列如下：PRM2：上游引物5'-CTCCGCCCTCCTC CCCTACTC-3'，下游引物5'-CCTCTTGGCCGTGGTGTCCTT-3'；GAPDH(内参基因)：上游引物5'-GGGG CTCTCCAGAACATCATCC-3'，下游引物5'-ACGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'。

1.3.4 实时荧光定量PCR反应使用20 μl的反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMII(2×)10 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference DyeⅡ(50×)，DNA模板2 μl，dH2O 6 μl。将反应管置于ABI 7500 Real-Time PCR System中进行扩增反应。使用两步法PCR扩增标准程序，Stage 1：预变性Reps：1，95.0℃30 s；Stage 2：PCR反应，Reps：40，95.0℃5 s，60℃34 s。△CT=Ct(PRM2)-Ct(GAPDH)，用2-△CT值来表示基因的相对表达量。

1.4 统计学方法所有数据均使用SASS19.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验，相关性分析采用双变量相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义，计量正态数据以均数±标准差(±s)表示，偏态数据以M(P25～P75)表示。

2 结果

2.1 两组之间各参数比较两组之间PRM2 mRNA水平、精子浓度、A级精子、A+B级精子比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组PRM2 mRNA水平、精子浓度、A级、A+B级精子的比较(±s)

表1 两组PRM2 mRNA水平、精子浓度、A级、A+B级精子的比较(±s)

2.2 PRM2基因mRNA表达水平与精子浓度、A级精子、A+B级精子之间的相关性分析Spearman相关系数分析表明，PRM2基因mRNA表达水平与精子浓度之间无相关性(相关系数=0.298，P=0.110)，PRM2基因mRNA表达水平与A级精子之间存在正相关性(相关系数=0.419，P=0.021)，PRM2基因mRNA表达水平与A+B级精子之间存在正相关性(相关系数=0.571，P=0.001)。

3 讨论

PRM1和PRM2是富含精氨酸的蛋白，生精过程中它们参加DNA的组装[8]。PRM1是一个由50个氨基酸残基组成的成熟蛋白。PRM2 mRNA作为一个前体蛋白被翻译，它由103个氨基酸残基组成，且经过蛋白水解切割，最终形成含有50个氨基酸的成熟蛋白[9]。PRM1和PRM2在精子形成的早期阶段，减数分裂后的单倍体精子阶段进行转录[10]。PRM1和PRM2 mRNAs在圆头精子阶段就已被发现存在，但这一阶段并没有发现相应蛋白[11-12]。PRM1和PRM2转录的翻译发起并完成于精子发展的长形精子阶段[13-15]。在哺乳动物精子发生过程中，染色质的结构被永久地修改，这个过程的第一步发生在单倍体圆形精子阶段，这一步包括过渡蛋白1和2(TNP1，TNP2)更换体组蛋白，在长形精子阶段，TNP1和TNP2被鱼精蛋白取代，在鱼精蛋白结合到精子核染色质后，基因转录的进程完全停止[16]。

人类精子，只有80%左右的核蛋白完全转换为鱼精蛋白，P1/P2在0.8～1.2[17]。近来认为，异常蛋白质的合成与异常的mRNA滞留有关，表明鱼精蛋白转录调控的缺陷可能会导致不育男性鱼精蛋白的缺乏[16]。PRM1几乎存在于所有的哺乳动物中，而PRM2只存在于人、鼠等一些哺乳动物中。在小鼠身上研究发现，PRM2对维持精子染色质的完整性是至关重要的，PRM2的缺陷，会导致精子DNA的损伤，当进行ICSI时，PRM2有缺陷的精子可以激活卵细胞，但仅有很少的一部分能够发展到胚囊阶段[18]。

一般认为，哺乳动物成熟精子的细胞核基因转录和翻译处于惰性状态，精子的唯一使命是将遗传物质，即基因组DNA完整精确地传递给子代。但是20世纪80年代末以来，关于哺乳动物精子中存在一些基因的mRNA的事实已被接受和承认[2-3]。近年来也重视其存在的可能意义和应用价值，研究者们主要从两个方面推测和研究精子mRNA的功能[3-6]：一种可能是精子成熟和生理功能的自身需要；另一种可能是传递入受精卵中，在遗传、受精卵发育等过程中起作用。

我们研究发现，少弱精子症患者精液精子的PRM2基因的mRNA表达水平低于正常人(P＜0.05)，这与国外相关报道[17，19-20]一致。另外PRM2基因mRNA表达水平与A级精子及A+B级精子之间存在正相关性，但我们研究没有提示PRM2基因mRNA表达水平与精子浓度间存在相关性。检测精液精子中PRM2基因的mRNA表达水平能在一定程度上反映精液精子的质量，我们推测精液精子中PRM2基因mRNA的表达水平能在一定程度上反映睾丸精子发生过程中的表达事件，可成为男性不育症病因研究、检测和临床治疗效果观察的一个重要指标。我们的研究初步探索了PRM2基因mRNA表达水平与少弱精子症之间的关系，但是由于男科不育症基因调控的复杂性，需要我们进一步开展更多的研究工作，以阐明内在复杂的作用机理。

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Research on the expression levels of PRM2 mRNA in patients with oligoasthenozoospermia.

WANG Cheng-rong1,BIAN Ting-song2,DING Zhi-xiang3,TAN Xiao-lin2,YANG Kai1.1.Nanjing University of TCM,Nanjing 210046,Jiangsu, CHINA;2.Department of Andrology,Changzhou Hospital of TCM,Changzhou 213003,Jiangsu,CHINA;3.Department of Laboratory,ChangzhouHospitalofTCM,Changzhou213003,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression levels of PRM2 mRNA in oligoasthenozoospermia patients and healthy men with normal semen sperm.MethodsTwenty patients with oligoasthenozoospermia were chosen as experimental group and 10 healthy men with normal semen sperm were chosen as control group.Then the sperm concentration,vitality and PRM2 mRNA levels between the two groups were compared.ResultsThere were statistical differences between experimental group and controlled group in the expression levels of PRM2 mRNA, sperm concentration,the percentage of grade A sperm and the percentage of grade A+B sperm(P＜0.05).And there was a positive correlation between PRM2 mRNA levels and the percentage of grade A sperm and the percentage of grade A+B sperm(correlation coefficients were 0.419 and 0.571,respectively;P were 0.021 and 0.001,respectively).ConclusionThe expression level of PRM2 mRNA may predict the patient's sperm quality in a certain extent.Since PRM2 mRNA levels could reflect the expression events in spermatogenesis,it is supposed to be an important indicator in the research of etiology,testing and clinical observation of treatment effect in male infertility.

Oligoasthenozoospermia;PRM2;mRNA

R698

A

1003—6350(2014)21—3127—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1228

2014-04-30)