李玲霞，王志巧，罗晓丽，宋丽娜＊，于珊珊，何成彦，赵丽纯，李洪军，赵海丰，武利涛

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.吉林大学药学院，吉林 长春130021；3.佳木斯大学第一临床学院，黑龙江 佳木斯154003；4.北京中医药大学东直门医院）

含 CUB 结构域蛋白1（CUB Domain－containing Protein 1，CDCP1）是一种细胞表面糖蛋白。研究证实CDCP1为一种新的干细胞标志物［1］表达失调与多种癌症的发生、发展相关［2－7］。CDCP1为肿瘤辅助诊断及治疗的潜在靶点。鉴于目前国内应用的CDCP1抗体制剂多为国外公司进口，因此研制CDCP1抗体制剂，可满足国内在系统地探讨CDCP1在肿瘤发生发展、免疫诊断和靶向治疗中的需求。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株及菌种与质粒

人肺腺癌细胞株A549由吉林大学中日联谊医院检验科保存、大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）、pGEX－KG由吉林大学中日联谊医院检验科保存。

1.2 主要试剂

Trizol（Invitrogen）、Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、rTaq聚合酶、dNTP、T4连接酶（TaKaRa）、胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒（爱思进生物技术公司）、IPTG、丙烯酰胺、N，N－甲叉双丙烯酰胺（Sigma）。

引物由上海生工合成，引物序列如下：上游引物：5’－CGC GGATCC ATG AGCTGCCCAGACGGAGTCAC－3’；下游引物：5’－CG GAATTC TCA AGACATCAGGGTTGCTGAGC－3’。

1.3 实验方法

1.3.1总RNA的提取 按Trizol试剂说明提取肺癌细胞系A549总RNA，测定RNA含量及260 nm和280nm的吸收值的比值。

1.3.2cDNA第一条链的合成 按Takara的Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit操作步骤完成。

1.3.3PCR反应 取cDNA 反应液1μl，加入0.5 ml PCR管中，分别加入2mmol／L dNTP 4μl，10×PCR缓冲液5μl，上、下游引物各1μl（10.0pmol／μl），Taq酶2.5U，加DEPC水至终体积50μl，反应条件为94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸1 min，32个循环后72℃延伸5min。取9μl PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在图像分析处理系统上观察、记录电泳结果。

1.3.4表达载体的构建 碱性裂解法小量制备质粒；酶切反应混合物经震荡混匀、孵育后得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收酶切产物并将产物进行琼脂糖凝胶电泳；……