赵江萍，陈海龙，王凤鸣

（1.北京军区联勤部门诊部，北京 100042；2.北京军区联勤部第六分部门诊部；3.江苏省常州市疾病预防控制中心）

2型糖尿病患者外周血中膜型及可溶性CD28分子的表达及意义

赵江萍1，陈海龙2，王凤鸣3

（1.北京军区联勤部门诊部，北京 100042；2.北京军区联勤部第六分部门诊部；3.江苏省常州市疾病预防控制中心）

目的分析2型糖尿病患者外周血中膜型及可溶性CD28分子的表达及其意义。方法分别收集2012年12月至2013年12月在北京军区联勤部门诊部就诊的30例2型糖尿病患者（糖尿病组）及同期30名健康体检者（对照组）的外周血，通过溶血及流式细胞术检测其外周血T细胞表面CD28分子的表达，酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中可溶性CD28的水平，并进行对比分析。结果糖尿病组外周血CD4＋CD28＋T细胞和CD8＋CD28＋T细胞显著低于对照组［（28.29±7.71）%比（32.77±4.28）%和（12.18± 3.17）%比（18.53±3.27）%，均P＜0.01］，血清中可溶性CD28水平显著高于对照组［（2.86±0.96）比（0.61±0.19）μg／L，P＜0.01］。结论协同刺激分子CD28很可能参与了2型糖尿病的免疫病理机制。

糖尿病，2型；抗原，CD28；T淋巴细胞

2型糖尿病是一种自身免疫性的慢性炎症性疾病，目前认为免疫功能及免疫调节的异常在其发病及并发症发生发展中发挥重要作用。CD28是CD28／B7超家族的协同刺激分子，表达在人类95%的CD4＋T细胞及50%CD8＋T细胞表面，参与T细胞的活化、增殖、分化及发挥免疫效应功能［1］，在老年免疫［2］、自身免疫［3］、肿瘤免疫［4］中的生物学作用均备受关注。现就2型糖尿病患者外周血T细胞表面膜型CD28分子的表达及血清中可溶性CD28的水平进行分析，探讨该分子在2型糖尿病免疫病理机制中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年12月至2013年12月在北京军区联勤部门诊部就诊的2型糖尿病患者30例为糖尿病组，其中男16例，女14例，年龄41～70岁，平均年龄（53.0±10.2）岁；另选取同期健康体检者30名为对照组，其中男16名，女14名，年龄年龄40～70岁，平均年龄（52.5±10.8）岁。所有2型糖尿病患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准，病程1～6个月，均无其他自身免疫性疾病、肿瘤和感染性疾病等，半年内均未使用过影响免疫功能的药物。所有受试者均知情同意。

1.2 主要试剂及仪器 小鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC、CD8-FITC、CD28-PE以及同型对照抗体IgG1-FITC、IgG1-PE（法国Immunotech公司）；溶血剂（美国Invitrogen公司）；可溶性CD28的酶联免疫吸附法（ELISA）法检测试剂（上海恒远生物科技有限公司）；流式细胞仪和离心机（美国Bec km an Coulter公司）；酶标仪（美国Bio-rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 膜型CD28分子表达水平的检测 取糖尿病组及对照组清晨空腹外周抗凝血各2 mL，加入流式管中（100μL／管），分别加入10μL／管的CD4-FITC＋CD28-PE或者CD8-FITC＋CD28-PE，并加入IgG1-FITC和IgG1-PE为同型对照，室温避光孵育20 min后加入溶血剂（100μL／管），充分混匀后37℃避光孵育10 min；加入预温的蒸馏水，待管中液体澄清透明后，加入3 mL PBS洗涤1遍后，以0.5 mL PBS重悬细胞。采用流式细胞术检测两组受试者外周血不同淋巴细胞亚群及膜型CD28的表达。

1.3.2 可溶性CD28水平的检测 取上述各空腹外周抗凝血，4000 r／min高速离心（离心半径10 cm）5 min分离血清后-20℃冷藏待检。检测前，将血清取出室温解冻后，经ELISA方法检测可溶性CD28的水平。

1.4 统计学处理 采用Graphpad Prism 5.01统计学分析软件，正态分布的结果数据采用Kolmogorov -Smirnov检验，组间比较采用非配对t检验。

表1 两组外周血不同淋巴细胞亚群及膜型CD28的表达（s，%）

表1 两组外周血不同淋巴细胞亚群及膜型CD28的表达（s，%）

组别例数CD4 CD8 CD4／CD8 CD28 CD4＋CD28＋CD8＋CD28＋对照组30 42.16±4.76 28.30±4.39 1.52±0.25 52.48±11 3.170 0.333 2.917 6.627 2.788 7.635 P值.53 32.77±4.28 18.53±3.27糖尿病组30 38.56±4.01 27.14±4.06 1.36±0.15 35.84±7.49 28.29±7.71 12.18±3.17 t值0.002 0.740 0.005 0.000 0.007 0.000

2 结果

2.1 两组受试者外周血不同淋巴细胞亚群及膜型CD28的表达 与对照组相比，糖尿病组外周血CD4＋T细胞、CD4／CD8、CD4＋CD28＋T细胞和CD8＋CD28＋T细胞均显著减少（均P＜0.05），膜型CD28分子的表达显著下降（P＜0.01），见表1。

2.2 两组受试者血清中可溶性CD28含量 与对照组相比，糖尿病组血清中可溶性CD28含量显著高于对照组［（2.86±0.96）μg／L比（0.61±0.19）μg／L，t＝12.60，P＝0.000］。

3 讨论

2型糖尿病是一种自身免疫性的慢性非感染性疾病，主要由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足导致的，常并发多种血管病变。近年来的研究显示，2型糖尿病患者存在着免疫功能紊乱和炎症介质的增加，特别是T淋巴细胞的活化及功能的异常在2型糖尿病免疫病理机制中发挥着重要的作用［5］。本研究发现，2型糖尿病患者外周血中各免疫细胞亚群表达失调，无论是CD4＋T细胞还是CD8＋T细胞表面的膜型CD28分子的表达都显著下调。近年来的研究表明，在某些病理状态下，如类风湿性关节炎［6］、多发性硬化症［7］、强直性脊柱炎［8］和Wegener肉芽肿病等［9］自身免疫性疾病中，CD4＋T细胞表面的CD28分子表达下调。CD4＋CD28-T细胞尽管表面丢失了CD28分子，但其在缺失共刺激信号的情况下仍然能够被功能性活化，产生大量的细胞因子，造成组织损伤。该群细胞具有细胞毒性，可以分泌细胞因子γ-干扰素（IFN-γ），IFN-γ通过血液或旁分泌作用干扰胰岛素的信号转导，影响胰岛素敏感性，导致胰岛素抵抗，参与糖尿病的免疫病理机制［10］。本研究结果提示2型糖尿病患者外周血中T细胞表面CD28分子的表达显著减少，为2型糖尿病患者外周血中CD4＋CD28-T细胞的异常增加提供了佐证。

另外，本研究采用ELISA方法检测了2型糖尿病患者和对照组外周血清中的可溶性CD28的含量。结果显示，2型糖尿病患者外周血中可溶性CD28的含量较健康对照组显著增加，提示很有可能T细胞表面膜型CD28分子脱落后进入血液，导致了可溶性CD28的增加。

总的说来，2型糖尿病患者外周血中膜型CD28和可溶性CD28均存在异常表达，CD28作为重要的协同刺激分子，其介导的协同刺激信号很有可能参与了2型糖尿病的免疫病理机制，其具体生物学作用尚待进一步研究。

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The significance and expression of serum membrane type CD28 and soluble CD28 of among 2 diabetes patients

ZHAO Jiangping*，CHEN Hailong，WANG Fengming（*Outpatient Department of Joint Logistics Department，Beijing Military Region，Beijing 100042，China）

WANG Fengming，Email：wfm0519＠hotmail.com

ObjectiveTo analyze the expression ofmembrane type CD28 and soluble CD28 in peripheral blood of type 2 diabetes patients.Methods The peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of 30 subjectswith type2 diabetes（diabetes group）and 30 healthy donors（control group）were collected from December 2012 to December2013 in the out-patient departmentof Outreach Logistics Departmentof Beijing Military Region.The expression of CD28 on T cells in peripheral blood of type 2 diabetes patients was detected by flow cytometry（FCM）.Thesecretion of soluble CD28 in serum was detected using the skills of Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The data was analyzed by the Graphpad Prism 5.01 program.ResultsThe percentage of CD4＋CD28＋and CD8＋CD28＋T cells in peripheral blood of type 2 diabetes patientswere（28.29±7.71）%and（12.18±3.17）%respectively，and were decreased markedly compared with healthy control（32.77±4.28%and 18.53±3.27%，P＜0.01 and P＜0.001）.Compared with control，the level of soluble CD28 was increased significantly in serum of type 2 diabetes patients（（2.86±0.96）vs（0.61±0.19）μg／L，P＜0.001）.Conclusion The costimulatory molecule CD28 maybe take part in the immunological pathogenesis of type 2 diabetes.

Diabetes Mellitus，Type 2；Antigens，CD28；T-Lymphocytes

R587.1

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.05.020

2014-06-02）

赵江萍，主管护师，Email：guchengerxiao＠163.com

王凤鸣，博士，副研究员，Email：w fm0519＠hotmail.com