曹丽军，杨 靖，耿凤珍，李慧卿，史 峥，时东彦

（1. 河北大学附属医院检验科，河北 保定 071000；2. 河北省临床检验中心，河北 石家庄 050000；3. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000）

携带NDM-1阴沟肠杆菌尿路感染株临床特点回顾性报告

曹丽军1，杨 靖2，耿凤珍1，李慧卿1，史 峥1，时东彦3

（1. 河北大学附属医院检验科，河北 保定 071000；2. 河北省临床检验中心，河北 石家庄 050000；3. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000）

…目的 对2012年7月分离自住院患者尿液标本携带NDM-1阴沟肠杆菌的临床特点、检测过程进行回顾性分析，探讨其耐药特征及产生机制，对控制“超级细菌”的流行提出意见。方法 依照CLSI标准，采用K-B法和MIC法检测耐药性，改良Hodge试验和金属酶试验检测产酶类型，聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因并进行测序。 结果 此株阴沟肠杆菌对亚胺培南和美罗培南等15种7个类别抗生素均显示耐药，改良Hodge试验阳性，金属酶表型初筛试验阳性，经基因扩增并测序后，与Genebank比对，表明与NDM-1基因有99%的相似性,并经河北省CDC确证报告该菌株为携带NDM-1阴沟肠杆菌。结论 该尿路感染携带NDM-1基因金属酶的阴沟肠杆菌株，其产生可能与患者年老体差、恶性肿瘤伴长时滞留尿管并长时多次应用过多种抗生素有关，因此特别强调严格侵入性导尿及滞留时限指征、规范抗生素使用，做好重点消毒、隔离，控制多重耐药株发生。

阴沟肠杆菌；碳青霉烯类抗生素；NDM-1基因检测；回顾性报告

NDM-1细菌又名-新德里金属-β-内酰胺酶-1（New Delhi Metallo-β-lactamase-1，blaNDM-1）或者简称NDM-1，也即所谓的“超级细菌”，这种超级细菌多对所有治疗重症感染的抗生素包括碳青霉烯类（carbapenes）在内的各类β-内酰胺类抗生素都具有很高的抗药性，已引起了世界范围的广泛关注[1-2]。选择2012年7月在河北大学附属医院住院患者临床送检的尿液培养标本中分离出的泛耐药阴沟肠杆菌作为研究对象，通过回顾菌株检测过程，探讨其耐药产生原因，倡导严格、规范抗生素使用指征，对控制“超级细菌”的发生有指导意义。

1 一般资料与方法

1.1 一般资料

菌株来源及病例简介：陈宝X，男，83岁，汉族，河北省保定市人，企业退休，糖尿病肾病、乙肝、肝硬化失代偿期、2011年确诊原发性肝癌晚期，在保定市某社区医院住院8个月余，期间间断性使用抗生素Ⅰ联-Ⅲ联不等，后因病情恶化（发热、昏迷）转入河北大学附属医院消化科住院。患者转院过程中即带有锁骨静脉插管和尿道插管，在转院过程中导尿管脱落，因患者睾丸及尿道口过于肿大，入院后请泌尿外科医师会诊并行导尿管植入术，同时留取尿液细菌培养，连续3次均培养出包括亚胺培南、美罗培南耐药的泛耐药阴沟肠杆菌。入院21 d终因年老、体弱、恶性肿瘤伴糖尿病肾病等疾病导致多器官衰竭病故。

1.2 仪器与试剂

vitek生化鉴定条（法国生物梅里埃公司）；美国BD PHOENIX-100全自动细菌鉴定药敏仪；PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司）；PCR试剂（上海生物工程有限公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 药物敏感试验

采用WHO推荐的K-B纸片扩散法[3]和美国BD PHOENIX-100全自动细菌鉴定药敏仪MIC药敏实验。药敏纸片为英国OXOID公司产品，结果判读依照CLSI 2012版[4]判断标准。药敏室内质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.3.2 改良Hodge试验

将0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922菌液1∶10稀释后均匀涂布在MH平皿上，中间贴美罗培南纸片，将实验菌株以美罗培南纸片为起点，沿离心方向划线，35 ℃ 培养过夜，抑菌圈内呈现出矢状者为阳性。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705作为阳性对照，ATCC BAA1706作为阴性对照。

1.3.3 金属酶表型初筛试验

阴沟肠杆菌配成0.5麦氏单位的菌液，均匀涂布于MH平板上，平板上分贴2片美罗培南（10 μg）纸片，并在其中一片美罗培南纸片上滴加EDTA（0.5 μmol）10 μL，35 ℃ 孵育18 h，观察各纸片抑菌环大小，如果加酶抑制剂与不加酶抑制剂的抑菌环直径相差大于5 mm为金属酶实验阳性。

1.3.4 基因扩增

分别用blaIMP、blaVIM、blaNDM、blaKPC、blaCTX-M等β内酰胺酶基因及外膜蛋白基因进行PCR扩增（表1）。

表1 PCR引物序列及扩增片段

1.3.5 测序与序列比对

PCR扩增产物由上海生物工程公司纯化后双向测序，序列经BLAST比对分析，以明确基因型。

2 结 果

2.1 药物敏感试验

该株菌对所有检测的β-内酰胺类抗生素、加酶抑制剂类抗生素、四环素类、磺胺类及氯霉素类等多种抗生素均显示耐药，对氨基糖苷类抗生素中阿米卡星敏感，喹诺酮类抗生素中左旋氧氟沙星敏感。

表2 K-B法及MIC法药敏试验结果

2.2 碳青霉烯酶筛选试验

改良Hodge实验结果显示阳性，金属酶表型初筛试验检测阳性。

2.3 基因检测

NDM-1 基因的核心序列PCR 扩增后，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分离，Goldview 染色后用凝胶成像系统观察结果，显示核心序列为阳性，结果见图1，与Genbank比对有99.99%的相似性。比对结果见图2。blaIMP、blaVIM、blaKPC、blaCTX-M和OMPK36基因检测均为阴性。

图1 基因扩增产物电泳

3 讨 论

3.1 “超级细菌”感染局限，主动筛查，正确干预，可控可防

近年来，携带NDM-1的多重耐药菌是倍受全球关注的公共卫生问题之一。在中国也陆续出现携带NDM-1菌株的感染报道，这些菌株出现的地理位置分布涵盖了中国的东、南和西部，地域分布的跨度比较大，并以肠杆菌科细菌为主，如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等[5-8]。但是截止目前，媒体所报道的携带NDM-1的多重耐药菌感染多为偶发事件，从“超级细菌”发现后的几年迹象来看，其感染发生不具有普遍性或广泛性，在传播上有局限性[1，8]。本报告发现的这株阴沟肠杆菌是河北地区医院内首先报告的携带NDM-1基因的高水平泛耐药阴沟肠杆菌。本院细菌室一经发现该泛耐药菌株后即刻通知感染控制办公室和相关主管医生及病区护士长，启动感染控制应急措施，迅速对患者和其病房内所触及物品采取了重点常规消毒和单间隔离措施，对所住病房有特殊标示，建议出入该病房的医护人员及陪护家属加强防护和手卫生，患者去世后对所住病房进行了终末消毒处理。由于医院采取了适当的措施，该病区在其后的住院患者中尚未分离到同种或同类菌株。说明此“超级细菌”是可控可防的，及时采取正确的干预措施能够起到杀菌、抑菌或控制作用的，不必引起恐慌。

3.2 严格指征，个性化规范治疗是预防或控制多重耐药菌产生或感染发生的重要举措

回顾分析本感染病例不难得出，年老、体弱，恶性肿瘤，尤其恶肿治疗削弱了人体免疫系统，且各种导管的使用使得细菌进入血液循环的机会大大增加， 个体免疫功能的缺失，侵袭性导尿管的应用和抗生素的不规范使用等都是诱发多重耐药菌产生甚至感染发生的重要危险因素，因此，对患者进行相应的操作时，必须明确指征，及时拔管；同时必要的行政手段和专题讲座，经常性的感染医师与微生物专业技师的对话沟通、查房或感染病例讨论、经验介绍等对规范使用抗生素，严格抗生素使用指征，并全程按严格规范进行治疗，也是预防或控制多重耐药菌产生或感染发生的重要举措。

[1] 孙长贵. 产 NDM-1 酶细菌研究进展[J]. 实验与检验医学杂志, 2011, 29(2): 99-101.

[2] 张永. 超级细菌研究进展及临床对策[J]. 国际呼吸杂志, 2012, 32(6): 431-434.

[3] 叶英妩, 李毓三, 申子瑜. 卫生部医政司全国临床检验操作规程[M]. 3 版. 南京: 东南大学出版社, 2006: 896-911.

[4] Clinical and laboratory standards institute(CLSI). 抗菌药物敏感试验执行标准 M100-S20[J]. 中华医学检验杂志, 2011, 11(特刊): 48.

[5] 邹明祥, 邬靖敏, 李军, 等. 产 NDM-1 肺炎克雷伯菌中国分离株的初步研究[J]. 中国当代儿科杂志, 2012, 14(8): 616-621.

[6] 刘仁坤, 梁慧, 张薇, 等. 一株阴沟肠杆菌中发现新德里金属 β 内酰胺酶[J]. 中华检验医学杂志, 2013, 36(6): 562-564.

[7] MULVEY M R, GRANT J M, PLEWES K, et al. New Delhi metallo-β-lactamase in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli, Canada[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(1): 103-106．

[8] 陈玲, 王红. 产 NDM-1 酶肺炎克雷伯菌的目前研究进展[J]. 临床和实验医学杂志, 2013, 12(3): 225-228.

(责任编辑：高艳华)

Retrospective report of clinical characterizations of an Enterobacter cloacae carrying NDM-1 associated with urinary tract infection

CAO Lijun1, YANG Jing2, GENG Fengzhen1, LI Huiqing1, SHI Zheng1, SHI Dongyan3
(1. Department of Laboratory Medicine, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Clinical Central Laboratory of Hebei Province, Shijizhuang 050000, China; 3. Department of Laboratory Medicine, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijizhuang 050000, China)

Objective A retrospective analysis in terms of clinical characteristics and detection was carried out for a case of Enterobacter cloacae bearing NDM-1 isolated from a urine specimen of an in-patient in our hospital in July 2012. The purpose of this paper was to render suggestions for controlling the epidemic of “superbugs”based on discussions regarding its antibiotic-resistant characterization and mechanism. Methods According to the recommendations of CLSI, susceptibility testing for antibiotics using K-B and MIC methods was performed. Carbapenemase production and its phenotypic were confirmed by modified Hodge test and metal-enzyme test. PCR for detecting and sequencing the antibiotic-resistance gene was also performed. Results This isolate was resistant to 15 antibiotics such as imipenem, meropenem and others which were classified into 7 categories. This isolation showed positive for modified Hodge test and screening test for detecting metal-enzyme phenotype. The DNA sequence of the isolation amplified by PCR showed 99% similarities comparing with NDM-1 gene cited in Genbank. It was confirmed as the first report of E. cloacae carrying NDM-1 by the CDC of Heibei Province.Conclusion The NDM-1-producing isolation may be related to the elder patient who was infirm, catheterized and experienced multi-drug treatments. Therefore, in order to lessen the incidents of multi-drug resistant strain, it is ideal that we should focus on the control over catheterization, the use of antibiotics and taking strict sterilization.

Enteroba cter cloacae; carbapenems antibiotics; NDM-1 gene detection; retrospective report

R446

A

1674-490X(2014)01-0033-04

2013-11-26

曹丽军（1963—），女，河北安新人，副主任检验师，主要从事临床微生物检验及细菌耐药性检测工作。E-mail: caolijun66@sina.com

时东彦（1973—），女，河北石家庄人，副主任检验师，博士，硕士生导师，主要从事临床微生物检测和细菌耐药机制研究。E-mail: shidongyan73@126.com