杨翠翠, 佟慧丽, 马兴红, 杜巍, 刘丹, 杨宇, 严云勤

东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030

利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因

杨翠翠, 佟慧丽, 马兴红, 杜巍, 刘丹, 杨宇, 严云勤

东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030

肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育, 牛 MSTN基因突变会出现“双肌”特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因, 获得敲除MSTN基因的细胞系, 为制备MSTN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体, 分别采用 PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染, 测序结果表明 TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因, 利用T7核酸内切酶1(T7E1)检测其突变效率, 结果显示电穿孔转染的敲除效率为20.4%。通过有限稀释法, 共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTN-/-和MSTN+/-), 其靶位点敲除的碱基数分别是1～20不等, 部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备。

TALENs; 牛; Myostatin; 敲除; 转染

肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)属于 TGF-β超家族, 通过控制成肌细胞的大小、数量和增殖速度来实现对肌肉生长的负调控[1]。MSTN在肌肉组织中特异性表达, 其活性的丧失或降低均会导致动物肌肉的过度发育, 表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加, 动物出现“双肌”性状[2]。MSTN基因的自然突变能够产生双肌牛[3], 与正常牛相比其瘦肉率高且质量好。因此, 通过基因敲除获得具有育种能力的敲除MSTN基因的转基因肉牛具有重要的生产实践意义。

目前, 基因重组(Gene recombination)、锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)等基因敲除技术应用于MSTN基因的研究报道很多[4～6], 但是存在一定的局限性, 如操作复杂、敲除效率低等, 很难获得MSTN基因敲除的细胞系。2009年, 植物黄单胞杆菌属(Xanthomonas)中 TAL效应子氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译, 利用TALEN技术进行基因敲除的研究进入了一个全新的发展阶段。2010年, Christian等[7]利用AvrBs3和 PthXo1中天然存在的 TALE重复序列分别与FokⅠ融合, 通过人工构建的TALENs实现了目标DNA的切割。2011年, Miller等[8]采用TALEN技术定向突变人的内源性基因NTF3和CCR5, 首次在哺乳动物中实现了TALEN介导的基因打靶。随着TALEN技术的迅速发展, 理论上TALEN能够实现对任意物种的基因打靶。

TALEN技术已在非洲爪蟾(Xenopus laevis)[9]、

1 材料和方法

1.1 材料

鲁西黄牛(LXHN)由山东省农业科学院提供。菌株 DH5α购于北京全式金生物技术有限公司, 4种TALE基本单元模块载体pA(NI)、pC(HD)、pG(NN)和 pT(NG)以及 pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列(简称 pCS2-FokⅠ表达载体)均由北京大学生命科学学院张博教授赠送。

1.2 方法

1.2.1 单元组装法构建TALENs表达载体

根据靶点预测网站(https://tale-nt.cac.cornell. edu/)对 MSTN基因进行靶点预测, 选用位于第二外显子且含有常用酶切位点的基因作为靶点(表1)。通过反复的酶切-连接反应构建MSTN基因TALE重复序列的左、右靶点, 将TALE重复序列与CIAP(NEB)去磷酸化的 pCS2-FokⅠ表达载体相连, 构建TALENs终载体pCS2-FokⅠ-MR和pCS2-FokⅠ-ML (TALENs表达载体)。质粒图谱见文献[15]。

1.2.2 鲁西黄牛(LXHN)原代胎儿成纤维细胞系的建立及转染

酶消化法用含 20%胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM培养液(Gibco)分离培养和建立 LXHN原代胎儿成纤维细胞系。

按每2×106个细胞共转染30 μg的TALENs表达载体, 将不含筛选标记基因的 TALENs表达载体分别采用 PEI和电穿孔两种转染方式转染生长至70%～80%的牛胎儿成纤维细胞中。

1.2.3 TALENs表达载体的活性检测

利用Tissue DNA Kit(Omega)在转染后48 h分别提取 PEI和电穿孔两种方式转染的细胞基因组总DNA, 根据GenBank已公布的牛MSTN基因序列以及确定的靶点位置, 利用 Primer5.0设计引物Sense(5′-TGGAAAGGAAGTAGGCTGCTCAT-3′)和Antisense(5′-TTCTCCTGGTTCTGGGAAGGTTA-3′),以提取的全基因组DNA为模板, PCR扩增目的片段。青鳉(Oryzias latipes)[10]、大鼠(Rattus norvegi cus)[11]、小鼠(Mus Musculus)[12]等模式动物的基因敲除研究中获得了成功, 但是目前采用TALEN技术成功敲除大型家畜的报道还很少[13,14], 尚未见到成功获得不含筛选标记基因的牛突变细胞系的报道。本研究构建了不含筛选标记基因MSTN的两个 TALENs真核表达载体, 获得了稳定敲除MSTN基因的牛胎儿成纤维细胞系, 为高产优质转基因肉牛的育种研究提供材料。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min; 95℃变性1 min, 63.2℃复性30 s, 72℃延伸1 min, 共35个循环; 72℃延伸10 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用凝胶回收试剂盒回收。PEI和电穿孔两种转染方式得到的PCR纯化产物, 与pMD18-T克隆载体连接, 均挑10个单菌落送由北京英俊公司测序。

表1 牛MSTN基因的靶点信息

1.2.4 TALENs表达载体突变率的检测

采用T7E1(NEB)检测TALENs表达载体的突变效率。纯化上述电穿孔和没有转染的PCR产物分别加缓冲液Buffer, 反应条件：95℃10 min; 95℃～85℃(-2.0℃/s); 85℃ 1 min; 85℃～75℃(-0.3℃/s); 75℃ 1 min; 75℃～65℃(-0.3 ℃/s); 65℃ 1 min; 65℃～55℃(－0.3℃/s); 55℃ 1 min; 55℃～45℃(-0.3℃/s); 45℃1 min; 45℃～35℃(-0.3℃/s); 35℃ 1 min; 35℃～25℃(-0.3℃/s); 25℃ 1 min; 4℃保存; 上述反应体系分别加入0.5 μL T7E1, 37℃反应30 min后, 琼脂糖凝胶电泳检测。采用灰度扫描软件(BandScan5.0)根据突变率的计算公式(突变率=1-(1-切除片段所占百分比)0.5)进行突变率的分析。

1.2.5 有限稀释法制备单细胞克隆

将电转染后的细胞 300～500个稀释至 100 mL含15% FBS的DMEM培养液中, 分别装入20个100 mm细胞培养皿中, 在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养, 48 h后换成新鲜的15% FBS的DMEM培养液和培养细胞24 h后的15% FBS的DMEM培养液, 每3 d换一次培养液。

1.2.6 MSTN突变细胞系的筛选

细胞培养皿中细胞克隆直径生长至2 mm以上,用阿拉伯数字从 1开始分别对细胞克隆编号, 用牙签刮取 1/3的细胞进行酶切鉴定。剩下的细胞继续培养, 至最小直径长至4 mm以上, 消化、收集突变细胞将其冻存用于后续研究。牙签刮取的细胞提取其基因组DNA, 通过PCR扩增TALENs作用靶位点下游共计约612 bp片段, 经 SpeⅠ酶切鉴定是否存在突变, 将突变细胞系的 PCR扩增片段纯化, 与pMD18-T克隆载体连接, 每个细胞克隆均挑10个单菌落送由北京英俊公司测序。采用同源性分析软件(DNAMAN)进行序列比对, 分析确定突变类型。

2 结果与分析

2.1 TALENs表达载体的活性检测

分别利用 PEI和电穿孔方法将构建好的TALENs表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞, 没有转染TALENs表达载体的细胞作为对照, 48 h后提取3种细胞基因组DNA, 通过PCR扩增含靶位点、大小为612 bp的片段。经测序分析：PEI转染的10个细胞样品中有1个样品出现8 bp(AATAAACT)的碱基缺失; 电穿孔转染的10个细胞样品中有2个样品出现碱基缺失, 大小分别为 7 bp(ACAATAA)和 10 bp(ATAAACTAGT)(表2)。

表2 MSTN基因突变的测序信息

2.2 TALENs表达载体突变效率的检测

TALENs表达载体转染细胞48 h后提取基因组DNA, PCR扩增后用T7E1酶切, 结果(图1)表明：对照组只有一条带, 表明没有发生突变; 电穿孔转染的细胞基因组经 T7E1酶切后出现两条带, 说明基因组发生了突变, 突变率为20.4%。

图1 T7E1鉴定结果M: DL5000 DNA相对分子质量标准; c: 对照组; 1: 电穿孔实验组; 箭头指突变型带。

2.3 细胞克隆的制备及MSTN突变细胞系的筛选

为制备 MSTN基因敲除细胞系, 利用电穿孔方法将 TALENs表达载体转染牛胎儿成纤维细胞, 通过有限稀释法获得86个细胞克隆。采用酶切和测序的方法确定细胞克隆的突变类型。

用SpeⅠ分别单酶切每个克隆的PCR纯化产物,没有转染 TALENs的细胞作为对照。结果表明, 14号克隆的PCR纯化产物完全不能切开, 而对照组能完全切开, 15、23、29、31、34、36、39、40和43号克隆的PCR产物没有完全被切开(图2)。TALENs表达载体在牛胎儿成纤维细胞中介导产生的突变类型均为小片段缺失/插入突变(表3)。根据细胞克隆的碱基突变类型, 43号克隆不只出现一种基因型, 说明这种细胞克隆可能不是由单一细胞生长而来。TALENs表达载体在细胞克隆中介导MSTN基因的突变效率见表4。

依据PCR产物测序峰图判断单细胞克隆MSTN基因的突变情况, 从图3的测序结果可以看出, 14号细胞克隆MSTN基因出现8 bp的碱基缺失(ctagtaaa)且只出现这一种基因型, 说明14号细胞克隆的靶位点发生了纯合突变并且是由一个细胞生长而来。14号细胞克隆MSTN基因出现了8 bp的碱基缺失, 导致该缺失位点以后阅读框移码的改变, 终止密码子提前出现, 缺失了 183个氨基酸, 使能够编码成熟蛋白的 109个氨基酸缺失, 不能产生MSTN基因编码的蛋白, 不能发挥应有的生物活性, 导致骨骼肌数量增加。从细胞克隆(图4)可以看出, 与未敲除的克隆相比, 14号克隆的细胞数量有所增加且细胞排列紧密, 细胞生长状态良好。

图2 突变克隆的酶切鉴定结果M: DL1500 DNA相对分子质量标准;“612 bp”指未切开的带; 箭头指示SpeⅠ切开的两条带。

表3 MSTN基因突变细胞克隆的靶序列信息

注：“－”表示缺失的碱基数, “+”表示插入的碱基数, “fs”表示读码框架发生改变。

表4 TALENs表达载体在细胞克隆中介导MSTN基因突变的效率

图3 MSTN-/-型突变细胞克隆的测序峰图左侧下划线表示左靶点TALE重复序列, 右侧下划线表示右靶点TALE的反向互补序列, 箭头指向缺失碱基。

3 讨 论

MSTN是研究牛“双肌”性状时发现的一种负向调控骨骼肌生长的基因[16]。在某些哺乳动物中,该基因编码区的突变可以增加肌肉量[17]。因此, 敲除MSTN基因可用于转基因肉牛的育种。近年来, 新的基因敲除技术不断涌现, 如基因重组、锌指核酸酶等, 其中TALEN技术近两年取得尤为迅猛的发展。TALEN技术既有与ZFNs相同的特点, 如构建简单、可精确地修饰复杂的基因组等, 又有比 ZFNs毒性小、脱靶率低、易设计等优点[18]。研究表明, 利用TALEN技术对不同序列平均每35 bp就可以设计一个TALEN靶向位置, 而ZFNs平均每500 bp才能设计出可实现基因打靶的位置, 证明TALEN技术更加优于ZFNs[19,20]。

早在30年前, 传统的基因重组技术就应用于基因功能的研究, 到2011年已经获得70 754个干细胞系、6503个基因, 但是由于同源重组率低、易脱靶等原因, 很难获得双敲除的细胞克隆[21]。TALEN技术作为一种新的基因敲除技术在国内外的研究报道很多, 但利用该技术对牛等大型家畜的报道还很少。2012年, Carlson等[14]直接用EGFP基因的mRNA和编码TALENs的mRNA显微注射到牛受精卵中, 这种方法虽然获得了突变的受精卵, 但费用较高且无法用于转基因肉牛的制备; 2013年, Xu等[13]利用含筛选标记基因的TALENs对牛MSTN基因的功能进行了研究, 但均未获得不含筛选标记基因MSTN-/-型的细胞克隆。本研究采用单元组装法构建的TALENs表达载体成本低且效率高, 获得了不含筛选标记基因MSTN-/-型的细胞克隆。后续仍需提高转染效率, 以期获得更多高效 MSTN-/-型的细胞系, 为高产优质转基因牛的育种提供材料。

转基因动物育种常利用抗性标记基因和药物筛选制备基因修饰细胞, 但含抗性基因的转基因动物作为食品具有潜在的风险。本研究获得的 10个MSTN基因敲除细胞克隆(包括 MSTN-/-和 MSTN+/-)不含有任何筛选标记基因, 可为高产优质转基因肉牛的育种提供优质材料。同时, 本研究筛选 MSTN基因突变细胞系的方法是直接取部分细胞进行酶切鉴定, 结果正确后测序, 这样就免去了将细胞系接种到细胞培养板中的传代过程, 减少了单细胞克隆在体外传代的次数。因此, 本研究采用的方法可大幅度缩短时间, 提高工作效率, 减少单细胞克隆体外培养的时间, 更加有利于转基因育种的研究。

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(责任编委: 张 博)

Myostatin knockout in bovine fetal fibroblasts by using TALEN

Cuicui Yang, Huili Tong, Xinghong Ma, Wei Du, Dan Liu, Yu Yang, Yunqin Yan

College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Myostatin (MSTN) can negatively regulate the growth and development of skeletal muscle, and mutations of bovine MSTN gene can cause a “double-muscle” feature. To knock out MSTN gene in bovine fetal fibroblast by transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and obtain MSTN knockout cell lines, we constructed one pair of MSTN-TALEN vector and transfected into bovine fetal fibroblast cells by PEI and electroporation. Sequencing results demonstrated that TALEN was available for MSTN knockout. T7 endonuclease 1 (T7E1) was used for the detection of mutation efficiency. The results indicated that knockout efficiency of electroporation transfection was 20.4%, and 10 MSTN+/-and MSTN-/-cell colonies were obtained via limiting dilution method. The deletion number of nucleotides ranged from 1 to 20, and some of them were frameshift mutation, which could provide the possibility in production of MSTN knockout cattle in the future.

TALENs; bovine; Myostatin; knockout; transfection

2013-12-16;

2014-03-29

国家转基因专项(编号：2011ZX08007-002)资助

杨翠翠, 硕士, 专业方向：分子克隆与基因敲除。E-mail: 806344748@qq.com

严云勤, 教授, 博士生导师, 研究方向：转基因动物。E-mail: yanyunqin@sohu.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0685

时间: 2014-6-4 16:11:41

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140604.1611.001.html