陈通威，赵 鹏(山西康宝生物制品股份有限公司，长治 046011;通讯作者，E-mail:ctw001@126.com)

细胞生物学、免疫学以及分子生物学是现代生物学三大前沿学科，细胞培养技术是细胞生物学研究领域中最常用的方法之一。尤其是在生物医药领域，许多基因工程药物、疫苗等都离不开最基本的细胞培养技术，人二倍体细胞系的建立使人用疫苗得到了长足的发展［1］。目前，人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)被国内外很多科研单位和细胞培养工作者使用［2，3］。

在体外培养细胞时，培养液的pH值过高或过低均会对细胞生长产生不利影响。戴永祥等曾经报道过 MRC-5 生长适宜的 pH 值为 7.4［4］，本文对MRC-5的生长pH值范围进行了扩展研究，找出了适宜MRC-5细胞生长的最佳pH值范围。在细胞培养过程中，细胞代谢产物的积累会改变培养液的pH值，故常用缓冲液或二氧化碳调节细胞培养液pH值，本文使用7.5%的碳酸氢钠溶液来调节细胞培养液的pH值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，经自行建库后备用，51万个/ml。

1.1.2 主要设备、器材与试剂 生化培养箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司。pH计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。倒置显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司。超净工作台，北京西泰科隆仪器技术有限公司。数显恒温三用水箱，金坛科兴仪器厂。高温电子灭菌炉，SANYO。高压蒸汽灭菌器，SANYO。渗透仪，WESCOR。T25细胞培养瓶，Nucn。细胞计数板，玉环县求精医用仪器厂。

硫酸庆大霉素，4万 U/ml，天津药业。MEM，0.95%，GIBCO。胎牛血清，民海生物。谷氨酰胺，高级纯，Amresco;配置成0.2 mol/L溶液。胰酶，1∶250，BD;配置成 0.25%溶液。NaHCO3，AR，国药集团;配置成7.5%溶液。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养液配制 MEM细胞培养液的配制:MEM 935 ml，胎牛血清 50 ml，谷氨酰胺 10 ml，庆大霉素5 ml。将上述溶液分成10份，每份100 ml，取9份，分别滴加不同体积的7.5%NaHCO3调节 pH 值，使培养液的 pH 值分别为 6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6。

1.2.2 细胞复苏与培养 将配制好的不同pH值细胞培养液各10 ml，加到T25培养瓶中。从液氮中取出冻存的细胞，迅速在37.0℃水浴箱中融化，取适量，分别加入装有不同pH值培养液的培养瓶中，轻微摇匀，放置在37.0℃生化培养箱中培养。第2天更换细胞培养液，以去除细胞冻存液里的二甲基亚砜(DMSO)，之后继续放37.0℃生化培养箱中培养。

1.2.3 观察细胞形态变化 每天用倒置显微镜观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、密度、增殖速度等，并拍照记录，直至细胞长成致密单层为止。

1.2.4 细胞计数 在同一生化培养箱中，37℃培养96 h后，取出培养瓶，倒掉培养液，加入适量的0.25%胰酶消化液，消化半分钟后倒掉胰酶消化液，作用约5 min直至细胞松散脱落，加入10 ml培养液吹打细胞至分散，制成细胞悬液。显微镜下观察不同pH值培养液中的细胞形态，并用细胞计数板对细胞数量进行计数统计。

细胞计数公式:1 ml细胞数=n个方格细胞数之和×稀释倍数×10 000/n，计算出不同pH值培养液中每毫升的细胞数。

2 结果

2.1 不同pH值培养液对细胞形态的影响

取出培养的细胞并置于倒置显微镜下进行形态观察，可见当培养液的pH值＜7.0时，MRC-5生长分裂速度缓慢，显微镜下细胞为圆球形，悬浮在培养液中(图1A);当培养液的pH值在7.0－7.1之间时，细胞形态与培养液pH值为7.2－7.3所培养的细胞形态相仿，唯一的区别是细胞分裂生长速度稍慢(图1B);当培养液的pH值在7.2－7.3之间时，MRC-5细胞分裂较快，增殖速度迅速，细胞形态良好，细胞均匀，呈典型的单一梭形外观，形成细胞群落(图1C);当培养液的pH值＞7.4时，MRC-5细胞逐渐停止分裂生长，细胞形态肥大、边缘不规则，且有部分细胞破碎(图1D)。

图1 不同pH值对细胞生长形态的影响Figure 1 Effect of pH on the morphology of MRC-5 cells

2.2 不同pH值培养液对细胞数量的影响

培养96 h后，分别对在pH值为6.8－7.6的培养液中生长的细胞进行计数，结果见表1。表1数据显示，当培养液的pH值＜7.0时，MRC-5细胞数目较低;当培养液的 pH值在7.0－7.1之间时，细胞数目相对增加;当培养液的pH值在7.2－7.3之间时，MRC-5细胞数目明显增多，且最高可达2.37×106/ml;当培养液的 pH 值 ＞7.4 时，MRC-5细胞数目明显降低，可见部分细胞破碎。

3 讨论

细胞培养对于基因工程药物和疫苗的实验室研究和工业化生产非常重要，而细胞生长的微环境对细胞的影响极大。细胞在体外培养，人们可以有计划、有选择、有目标地控制细胞生长的环境，从而可以研究某些特殊条件下的细胞生物学行为。确立细胞培养条件，需要在培养温度、血清浓度、培养液成分、培养液pH值及培养液渗透压等方面进行反复实验。其中pH值对细胞行为的影响最大，也最为关键，对细胞工业化生产起着至关重要的作用［1］。

表1 pH对细胞数量的影响 (n=3)Table 1 Effect of pH on cell number of MRC-5 (n=3)

人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)作为国际认可的人二倍体细胞标准株，因用其生产出的生物制品无外源因子、无外源性细胞残余DNA和无致瘤性。李亚东等报道，在显微镜下观察，MRC-5细胞呈单一梭形，细胞均匀［5］。本文用不同pH值的培养液培养MRC-5细胞，经显微镜观察，分别从细胞形态变化和细胞数量统计两个方面进行了分析研究，旨在确定MRC-5细胞生长的最佳pH值范围。

实验结果表明，当培养液的 pH值 ＜7.0时，MRC-5细胞生长缓慢，形态也不规则;当培养液的pH值在7.0－7.1之间时，细胞的分裂生长速度有所提高，形态也变得规则;当培养液的pH值范围为7.2－7.3时，最适合 MRC-5生长，细胞形态规则，状态良好，且增殖速度最快;当培养液的pH值＞7.4时，细胞生长速度变得很慢，甚至停止分裂生长，部分细胞破碎、变形。

通过实验还可以看出，MRC-5细胞对pH值＞7.4的碱性培养液较敏感，细胞变形严重;而对pH值＜7.2的酸性培养液，细胞则其有一定的耐受，故配制细胞培养液时宁可稍偏酸也勿稍偏碱。如果实验条件允许的话，最好在使用前先测定其pH值，以确保培养液的pH值是在细胞生长的最适范围内。同时，还应每天注意观察细胞生长的情况及细胞培养瓶中培养液的颜色变化，以便及时换液或添加NaHCO3。对于条件较好的实验室，可以直接将细胞培养瓶瓶口微旋，放入CO2孵箱中培养，在饱和湿度、37 ℃、5%CO2培养条件下培养［6，7］，这样可以使细胞在整个生长周期中的pH值保持恒定，避免在细胞生长后期因数量多、代谢快而引起细胞培养液的pH值下降，最终导致细胞的脱落和死亡。

细胞培养最适生长条件是实验成功、企业规模化生产的前提，本文对MRC-5细胞培养液的最适pH值范围进行了科学性和重复性研究，为MRC-5细胞培养后续阶段的研究打下坚实的基础。

［1］ 李元.基因工程药物［M］.北京:化学工业出版社，2002:82－86.

［2］ 张文娟，纪卫东，杨淋清，等.人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰研究［J］.卫生研究，2009，38(2):139－143.

［3］ Saeed K，Pelosi E.Comparison between turnaround time and cost of herpes simplex virus testing by cell culture and polymerase chain reaction from genital swabs［J］.Int J STD AIDS，2010，21(4):298－299.

［4］ 戴永祥，管政德，胡晓玉，等.人二倍体细胞 KMB－17株和MRC-5株生物学性质比较［J］.动物学研究，1985，6(4):313－317.

［5］ 李亚东，牛建昭，王继峰，等.循环纤维细胞和人胚肺成纤维细胞的比较研究［J］.解剖学报，2007，38(3):300 －303.

［6］ 李映红，吴正治，吴伟康，等.天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究［J］.深圳中西医结合杂志，2007，17(6):336－340.

［7］ 娄小燕，孙爱军，王克强，等.电转染技术促进人胚肺二倍体成纤维细胞的衰老进程究［J］.上海医学，2009，32(4):308－311.