李 晓，姜 萍，林海青，徐向东，杨金龙，马度芳，于潇华，姜月华

（1.山东中医药大学附属医院，山东济南 250011；2.山东中医药大学临床学院，山东济南 250355）

在多种心脏疾病中，如心肌梗死、冠心病、心力衰竭等，交感神经损伤后进行修复，可能导致心脏交感神经的分布、密度和空间排布的改变，即心脏交感神经重构，主要表现为区域性交感神经去支配和高支配现象［1］，造成交感神经对心肌活动支配的不均一性，可进一步导致心肌电生理紊乱。交感神经失支配往往是由于交感神经纤维坏死或损伤导致，而交感神经高支配是在神经的修复过程中由于神经轴突芽生（axon regenernation or sprouting）引起，交感神经的这种重构现象多见于器质性损伤（如心肌梗死、心肌病）后的修复阶段，如在心肌梗死后，在梗死区出现交感神经缺失，而在梗死区周边心交感神经芽生和密度增高，易引起室颤和心源性猝死的发生［2］。

对于交感神经的不均一性，我们希望从中医药中寻找治疗方药。传统中医古方桂枝汤对动物的心率和血压具有双向调节［3］。临床上用桂枝汤加减方治疗冠心病、心律失常、低血压、高血压等循环系统疾病也取得一定的疗效［4］。另外，采用桂枝汤或加味方［5-6］治疗出汗异常、肠易激综合症、更年期综合症、神经源性膀胱等涉及自主神经紊乱的疾病也取得较好疗效，由这些临床经验推断，中医方剂桂枝汤及其加减方或类方可以对交感神经起到双向调节作用，这对交感神经的不均一性的治疗是一个非常有探索价值的课题，本实验仅对交感神经芽生作研究，并初步探索桂枝汤以及桂芍1∶2和2∶1不同配伍比例的作用差异。

4-甲基邻苯二酚（4-methylcatechol，4-MC）是内源性神经生长因子（NGF）合成刺激剂，4-MC慢性注射可以诱导心交感神经芽生，增加交感神经分布密度，可用于建立心脏交感神经芽生大鼠模型［7］。目前研究表明，β受体阻滞剂如美托洛尔可降低交感神经张力［8］、抑制心肌梗死引起的交感神经芽生［9］。本研究观察桂枝汤原方对4-MC诱导的大鼠心脏交感神经芽生是否具有抑制，并与美托洛尔的作用对比。

1 试剂与方法

1.1 实验试剂与药品 4-甲基邻苯二酚（4-MC）（美国 Sigma-Aldrich公司产品，批号：452-86-8）；美托洛尔（阿斯利康制药有限公司产品）；ELISA法检测去甲肾上腺素（NE）、生长相关蛋白（GAP-43）、酪氨酸羟化酶（TH）、乙酰胆碱酶（CHAT）试剂盒（R＆D 公 司 产 品，货 号 10391RT、10190RT、10234RT、10538RT，中国上海博蕴公司分装，批号201120817）。兔抗大鼠酪氨酸羟化酶（TH）IgG多抗（英国Abcam公司产品，批号：ab51199）。TRITC标记的山羊抗兔IgG二抗（北京ZSGB-Bio公司产品，批号：ZF-0316）。山羊封闭血清（北京中杉金桥生物技术有限公司产品，批号：100418）。福田单道心电图机，型号FX7000。

1.2 实验动物与分组给药 SPF级Wistar大鼠60只，♂，280～320g，由山东中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK鲁20110003）。取10只为正常对照组，注射等量生理盐水。大鼠50只以4-MC 10 mg·L-1（10μg·kg-1体重）腹腔注射，每日 1次，诱导建立大鼠心脏交感神经芽生模型，连续注射30 d后，随机分为模型对照组、美托洛尔组、桂枝汤1∶1组（桂芍1∶1组）、桂枝汤1∶2组（桂芍1∶2组）、桂枝汤2∶1组（桂芍2∶1组）。

桂枝汤组成药物和美托洛尔（倍他乐克）购于山东省中医院，桂枝汤方组成为桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大枣，按照比例，水煎煮，至终浓度为1.5 g（生药）·ml-1（山东中医药大学附属医院制剂室加工制作）。倍他乐克（AstraZenecaAB公司，批号：CN52-039C-3633）配制为浓度0.15 g·L-1的混悬液。

给药方法：美托洛尔组以美托洛尔10 mg·kg-1体重灌胃；桂枝汤1∶1组，4 g（生药）·kg-1体重灌胃；桂枝汤1∶2组和桂枝汤2∶1组分别为5.5 g（生药）·kg-1体重灌胃，灌胃量均为1 ml，连续灌胃30 d。正常对照组给予1 ml生理盐水灌胃。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠心电图 2%戊巴比妥钠（20 mg·kg-1）腹腔注射浅麻醉，固定大鼠四肢，记录大鼠肢体导联的心电图，并测量心率。心电图共检测3次，时间分别为造模前、注射4-MC 30 d时和灌胃30 d后。

1.3.2 标本的获取 2%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，腹腔取血，并迅速剪取心脏，冰生理盐水漂洗，称量全心重，并分离剪取右心房、左心室。右心房和左心室矢状位平均剪成两部分，一部分10%的中性甲醛固定，进行常规病理HE染色和免疫荧光观察；另一部分右心房和左心室加入生理盐水（1∶20）进行组织匀浆，ELISA法检测心肌中的神经递质和细胞因子的含量。

1.3.3 ELISA法检测心肌匀浆中去甲肾上腺素（NE）、生长相关蛋白（GAP-43）、酪氨酸羟化酶（TH）、乙酰胆碱酶（CHAT） 严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 免疫荧光法观察右心房、左心室中神经的分布 免疫荧光法检测酪氨酸羟化酶（TH）。标本于-20℃厚度7μm切片，丙酮固定。PBS洗3 min×5次；山羊血清37℃封闭40 min；滴加兔抗大鼠酪氨酸羟化酶（TH）IgG一抗（1∶300），4℃过夜；PBS洗5 min×5次；滴加TRITC标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶100），37℃1 h；PBS洗5 min×3次。DAPI复染5 min，Leica DC-300F荧光显微镜暗视野下观察拍照。

1.4 统计学分析 使用SPSS 17.0进行统计分析。数值以¯x±s表示。除非另有说明，使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计比较。

2 结果

2.1 大鼠一般状况 除去造模、灌胃等因素死亡，各组大鼠数量见Tab 1，各组大鼠间体重、一般状态、解剖后心重均无差异；但模型对照组心重与体重比与正常对照组比较明显升高，各用药组心重与体重之比较模型对照组明显下降（P＜0.05），见 Tab 1。

Tab 1 Ratio of heartweight and body weight of rats

2.2 大鼠心电图和心率的变化 大鼠造模前、注射造模30 d和灌胃30 d的心电图，J点和T波前后对比差异无显著性，图形差异无显著性（Fig 1）。

在4-MC注射造模前，各组大鼠心率无差异。4-MC腹腔注射30 d后，各4-MC注射组心率均明显上升（P＜0.05）；药物灌胃治疗30 d后，未治疗的模型对照组大鼠心率仍高于正常对照组大鼠，各用药组心率呈现不同程度的下降，其中桂枝汤1∶1组大鼠心率下降程度最大（Tab 2）。

Tab 2 Changes of heart rate of rats（bpm）

Fig 1 Electrocardiogram of each groupA：Normal group；B：Modelgroup；C：Metoprolol group；D：Guizhidecoction1：1 group；E：Guizhidecoction1：2 group；F：Guizhidecoction2：1 group

Fig 2 Immunofluorescence staining of TH positive nerve fibers in heart（×100，Bar：100μm）A：Normal group；B：Modelgroup；C：Metoprolol group；D：Guizhidecoction 1：1 group；E：Guizhidecoction 1：2 group；F：Guizhidecoction 2：1 group

2.3 心肌匀浆中NE、GAP-43、TH、CHAT的含量与正常对照组比较，模型对照组大鼠心肌内反映交感神经活性的NE、GAP-43和TH均明显升高（P＜0.05），各组副交感神经标记物CHAT无差异，表明4-MC对副交感神经无影响。各用药组NE、GAP-43、TH有不同程度的减少（P＜0.05），以美托洛尔组和桂枝汤1∶1组下降程度最为明显，说明各药物均可有效抑制交感神经芽生，但以美托洛尔组和桂枝汤1∶1组药效最佳（Tab 3、4）。

2.4 免疫荧光 交感神经被标记为红色，细胞核呈蓝色。模型对照组右心房和左心室中TH阳性密度明显高于其它组，即交感神经在心肌中分布密度增加，而各药物治疗组心脏交感神经分布趋于正常。相对于模型对照组，各药物治疗组心肌细胞排列较为规则，形态未出现明显异常改变（Fig 2）。

Tab 3 Content of NE，GAP-43，TH and CHAT in right atrial

Tab 4 Content of NE，GAP-43，TH and CHAT in left ventricular

3 讨论

缺血性心脏病在梗死周围区域的心肌出现异常活跃的交感神经再生，大量的交感神经芽生造成心肌局部交感神经高支配现象，导致心脏中交感神经分布不均，是恶性心律失常和心源性猝死的重要原因之一。另外，交感神经亢进参与心肌肥大细胞激活局部组织肾素-血管紧张素系统的过程［10］。因此，抑制交感神经过度芽生，恢复心脏自主神经平衡是治疗心脏疾病的重要目标之一。

研究结果显示，给予大鼠注射4-MC后制备交感神经芽生模型，模型对照组心率明显高于正常对照组，表明交感神经对心脏传导系统的高支配现象。模型对照组大鼠心重与体重之比明显高于正常对照组，可能是由于交感神经亢进使得心脏中神经内分泌紊乱，导致心肌细胞肥大增生，心肌外胶原沉积而出现心室组织重构［11］。GAP-43是一种在神经发育和再生过程中与轴突生长有关的膜结合磷酸化蛋白，存在于交感神经和迷走神经以及感觉神经中，其表达增加可作为神经生长和损伤后再生的标志［12-13］。TH可作为交感神经特异性的标志，且能反映交感神经活性［14］。CHAT为迷走神经的特异性标志物［15］。本研究显示模型对照组大鼠心肌匀浆中GAP-43和TH均升高，而副交感神经的标志物CHAT未改变，同时，免疫荧光也显示TH升高。表明4-MC可诱导交感神经增生，表现为交感神经分布和活性增高，而对副交感神经无明显影响。而在给予药物干预后，美托洛尔组心率和心重与体重之比均低于模型对照组，且心肌中的NE、GAP-43和TH也低于模型对照组，表明美托洛尔可抑制心脏中交感神经芽生，这与Yan等［16］的研究相同。相比美托洛尔组，桂枝汤桂芍不同配伍组也可减轻心脏中交感神经芽生，其中以桂芍1∶1组和桂芍1∶2组最为明显，而且由免疫荧光可见，桂芍1∶1组与桂芍1∶2组心肌中交感神经分布少于美托洛尔组。因此，桂枝汤在抑制交感神经芽生方面作用与美托洛尔相同，其中桂芍1∶1配伍和桂芍1∶2配伍作用优于桂芍2∶1配伍。

美托洛尔作为最常用的β受体阻断剂，在临床上可用于降低交感神经张力，在心衰、冠心病的治疗中不仅可以降低交感神经亢进，而且对心脏病的长期预后有明显效果，之前的研究证明，β受体阻断剂可减少离体豚鼠心脏和经麻醉狗的心脏中交感神经刺激引起的 NE释放［17-18］。Yan等［16］的研究证明美托洛尔可降低心肌梗死后家兔心脏中交感神经芽生，减少心梗后心律失常的发生。但是，在交感神经重构中可同时存在交感神经高支配和失支配现象［8］，针对这种矛盾的病理现象，需要探索新的治疗药物，而根据中医药理论，中药方剂桂枝汤具有潜在的双向调节作用。由本实验我们证明了桂枝汤可抑制交感神经芽生，并初步探索了不同桂芍配伍比例的作用差别，在针对交感神经重构这种相互矛盾的病理现象中，显示出桂枝汤的治疗优势。

桂枝汤能有效降低心肌中NE、GAP-43、TH的含量，减轻4-MC诱导的心脏交感神经芽生，其中以桂芍1∶1配伍和桂芍1∶2配伍效果最好，作用与美托洛尔相似。

参考文献：

［1］ Chen PS，Chen L S，Cao JM，etal.Sympathetic nerve sprouting，electrical remodeling and themechanisms of sudden cardiac death［J］.Cardiovasc Res，2001，50（2）：409-16.

［2］ Cao JM，Chen L S，KenKnight B H，et al.Nerve sprouting and sudden cardiac death［J］.Circ Res，2000，86（7）：816-21.

［3］ 秦彩玲，刘 婷，张 毅，等.桂枝汤对大鼠血压双向调节作用及其有效部位探讨［J］.中国实验方剂学杂志，2001，7（4）：20-3.

［3］ Qin C L，Liu T，Zhang Y，et al.Experiment studies on dual-directional regulation of Guizhitang for rat blood pressure and its active fractions of Guizhitang［J］.Chin JExper TraditMed Formul，2001，7（4）：20-3.

［4］ 王虎平，吴红彦.桂枝汤功用述评［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14（2）：77-9.

［4］ Wang H P，Wu H Y.The statement and evaluation on function of ramuli-cinnamomi decoction［J］.Chin J Exper Tradit Med Formul，2008，14（2）：77-9.

［5］ 张保国，梁晓夏，刘庆芳.桂枝汤现代药效学研究［J］.中国中药杂志，2007，32（7）：557-61.

［5］ Zhang BG，Liang X X，Liu Q F.Modern pharmacodynamic study of Guizhi decoction［J］.China JChin Mat Med，2007，32（7）：557-61.

［6］ 曹爱梅.经方辨治糖尿病合并自主神经病变验案5则［J］.国医论坛，2003，2：8.

［6］ Cao A M.Fivemedical cases of treatment diabetic autonomic neuropathy with classical prescriptions［J］.Tradit Chin Med Forum，2003，2：8.

［7］ Saita K，Ohi T，Hanaoka Y，et al.A catechol derivative（4-methylcatechol）accelerates the recovery from experimental acrylamide-induced neuropathy［J］.JPharmacol Exp Ther，1996，276（1）：231-7.

［8］ 郭继鸿.交感神经重构［J］.临床心电学杂志，2008，17（4）：311-6.

［8］ Guo J H.Sympathetic remodeling［J］.J Clin Eletrocardiol，2008，17（4）：311-6.

［9］ Wang Y，Liu J，Suo F，etal.Metoprolol-mediated amelioration of sympathetic nerve sprouting after myocardial infarction［J］.Cardiology，2013，126（1）：50-8.

［10］Mackins C J，Kano S，Seyedi N，et al.Cardiacmast cell-derived renin promotes local angiotensin formation，norepinephrine release，and arrhythmias in ischemia/reperfusion［J］.J Clin Invest，2006，116：1063-70.

［11］Banki N M，Kopelnik A，Dae MW，etal.Acute neurocardiogenic injury after subarachnoid hemorrhage［J］.Circulation，2005，112：3314-9.

［12］严恒林.生长相关蛋白（GAP-43）与神经发育和再生［J］.神经解剖学杂志，1993，9（2）：155-62.

［12］Yan H L.Growth association protein is related to nerve development and regeneration［J］.JNeuroanatomy，1993，9（2）：155-62.

［13］Stewart H J，Cowen T，Curtis R，et al.GAP-43 immunoreactivity is widespread in the autonomic neurons and sensory neutons of the rat［J］.Neuroscience，1992，47（3）：673-84.

［14］Burgi K，CavalleriM T，Alves A S，etal.Tyrosine hydroxylase immunoreactivity as indicator of sympathetic activity：simultaneous evaluation in different tissues of hypertensive rats［J］.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300：264-71.

［15］Arvidsson U，Riedl M，Elde R，et al.Vesicular acetylcholine transporter（VAChT）protein：a novel and uniquemarker for cholinergic neurons in the central and peripheral nervous systems［J］.JComp Neurol，1997，378：454-67

［16］Yan SH，Hu H S，Wang X L，etal.Effectsofprolongedmetoprolol treatment on neural remodeling and inducible ventricular arrhythmias after myocardial infarction in rabbits［J］.Int J Cardiol，2007，117（3）：317-22.

［17］Yamaguchi N，de Champlain J，Nadeau R A.Regulation of norepinephrine release from cardiac sympathetic fibers in the dog by presynaptic alpha-and beta-receptors［J］.Circ Res，1977，41（1）：108-17.

［18］Adler-Graschinsky E，Langer SZ.Possible role of a beta-adrenoceptor in the regulation of noradrenaline release by nerve stimulation through a positive feed-backmechanism［J］.Br JPharmacol，1975，53（1）：43-50.