丁 慧，陈 虹，姜 勇，屠鹏飞，马婧怡，张万鑫

（1.石河子大学药学院，教育部新疆特种植物药资源重点实验室，新疆石河子 832002；2.北京大学中医药现代研究中心，北京 100083）

松果菊苷 （echinacoside，ECH）是从新疆特色植物、国家重点保护野生药材肉苁蓉中分离、纯化的苯乙醇苷类化合物的主要成分［1］。前期大量研究实验结果证实，ECH有明显的神经保护作用。主要表现在抗活性氧自由基损伤的作用［2］、抗神经元凋亡作用［3］、提高学习记忆能力［4］和抗衰老作用［5］。本实验室研究发现松果菊苷有明显的对抗脑缺血损伤中单胺类神经递质升高的作用［6］。阿尔采末病（Alzheimer’s disease，AD）是一种多病因的以进行性认知障碍和记忆能力损害为特征的中枢神经系统退行性疾病。AD是继心血管疾病、癌症和脑卒中之后第四大病魔，并随着人口老龄化日益严重，AD的发病率呈明显上升趋势。本文通过观察ECH对氧自由基引起的AD模型大鼠学习、记忆功能的影响，初步探讨ECH改善AD的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 ECH由北京大学屠鹏飞教授惠赠 （纯度95%以上）；Aβ25-35、D-半乳糖（Sigma公司）；石杉碱甲片 （哈伯因，河南太龙药业股份有限公司，批号：120708）；SOD、MDA、NO、NOS试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物 SD大鼠，♂，体质量290～320 g，购自新疆实验动物研究中心，许可证编号：SCXK（新）：2011-0002，饲养条件为室温20℃ ～23℃，湿度为50%～70%，自由进水、摄食，自然光照。

1.3 主要仪器 DMS-2型Morris水迷宫，中国医学科学院药物研究所；美国 BAS 4100型大鼠脑立体定位仪；Varioskan Flash 4.00.51酶标仪，美国Thermo electron公司。

2 方法

2.1 Aβ25－35的孵育［7］0.9% 无菌生理盐水加入Aβ25-35（2 g·L-1），保存在 -20℃，使用前在37℃恒温箱孵育7 d，使其变成凝聚态。

2.2 模型建立 大鼠采用腹腔注射D-半乳糖，100 mg·kg-1，每天1次，共计56 d，于d 43腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml·kg-1），等到大鼠翻正反射消失后，固定于大鼠脑立体定位仪上，前齿与双内耳保持在同一水平面，颅顶部备皮，纵行切口约1 cm并暴露硬骨膜，参照George Paxinos《大鼠脑立体定位图谱》［8］，以前卤为基点，定位于大鼠右侧海马（坐标 AP：＋3.5 mm；ML：＋2.0 mm；DV：-3.0 mm），骨科钻在定位处打孔，用5μl微量注射器开孔处垂直进针，注射速度调至1μl·min-1，注射时间5 min，匀速注射5μl凝聚态 Aβ25-35，并留针5 min，使溶液充分弥散，缓慢退针。缝合切口，每只大鼠注射0.2 ml硫酸庆大霉素防治感染。假手术组与模型组每日同时腹腔注射等量的生理盐水，43 d相同部位脑内注射等容积的生理盐水。

2.3 分组及给药 将复制成功的60只AD模型大鼠随机分为6组，每组10只，按以下剂量分别腹腔注射给予：ECH低剂量组 （10 mg·kg-1）、ECH中剂量组 （20 mg·kg-1）、ECH高剂量组 （40 mg·kg-1）、阳性药石杉碱甲组 （Hup-A，0.02 mg·kg-1）、模型组和假手术组 （生理盐水 1 ml·kg-1），每天1次，连续4周。

2.4 学习记忆能力测试 用Morris水迷宫方法衡量各组大鼠学习记忆的能力，实验可分为：①前5 d进行定向航行试验：记录2 min内大鼠依次从4个象限入水到爬上平台所需时间（逃避潜伏期）。②d 6撤去平台，进行空间探索实验：记录大鼠由相同入水点在2 min内穿过原平台位置的次数及路径长度。

2.5 SOD、MDA、NO、NOS试剂盒测定 Morris水迷宫测试结束后，按照试剂盒说明书要求，严格操作，测定各组大鼠皮质、海马组织中SOD、MDA、NO、NOS的活性。

2.6 统计学分析 结果数据均以±s表示，采用SPSS 17.0统计分析软件，t检验进行组间比较。

3 结果

3.1 ECH对AD大鼠学习记忆能力的改变 不断连续的训练，使得各组大鼠的逃避潜伏期随着训练的次数增加而缩短，但在测试的d 4、d 5，模型组大鼠相比ECH低、中、高、石杉碱甲组的逃避潜伏期差异具有显著性（P＜0.01，P＜0.05）；d 6模型组2 min内穿越平台次数明显少于其他各组的次数（P＜0.05）。见 Tab 1，Fig 1、2。

Tab 1 Results of place navigation test of Morriswater maze of rats¯x±s，n＝10）

Tab 1 Results of place navigation test of Morriswater maze of rats¯x±s，n＝10）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Treatment group Latency/s Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Sham - 55.03±21.24 49.60±17.19 26.77±9.97 20 Dose/mg·kg-1.18±6.34 7.55±5.31 Model - 59.52±20.63 56.88±14.32 57.39±6.37＃ 53.28±9.71＃＃ 43.21±14.89＃＃ECH-L 10 61.32±10.15 45.37±17.13 37.10±6.26** 33.96±8.52* 18.04±6.65**ECH-M 20 57.49±18.52 41.82±18.02 34.71±8.45** 26.89±11.57** 16.79±5.39**ECH-H 40 56.18±15.39 44.79±12.54 35.03±7.19** 23.55±10.03** 13.69±4.28**Hup-A 0.02 58.63±11.25 43.50±15.42 36.66±8.84** 27.17±7.37** 14.78±4.41**

Fig 1 Result of spatial probe test of Morriswater maze of rats（¯x±s，n＝10）＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Fig 2 Representative paths from the place navigation test

3.2 ECH对各组大鼠脑组织中NO、MDA含量和SOD、NOS活性的影响 见Tab 2，3。

4 讨论

Morris水迷宫是目前较为客观的、最常用于验证认知疾病模型的建立、评价与脑功能有关的学习记忆的能力和判定神经认知治疗有效性［9］。大鼠的空间记忆能力越好，其逃避潜伏期越短，于空间探索航行即大鼠穿越平台的次数越多。实验结果显示，AD模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿过平台的次数明显下降，游泳路径多为边缘式和随机式，证明其空间学习记忆能力严重下降；ECH低、中、高剂量组均使大鼠学习记忆能力不同程度的提高，3组潜伏期明显低于模型组，ECH高剂量组与石杉碱甲组比较差异无显著性，提示ECH对D-半乳糖联合Aβ25-35导致的获得性记忆损伤有改善作用。

过量的氧自由基被认为是引起大脑内神经元细胞损伤、神经元密度降低造成动物学习记忆能力退化的潜在因素［10］。脑组织是自由基连锁反应和脂质过氧化作用的靶组织，由于大脑的耗氧量最高，其丰富的脂质含量和相对于其它组织缺乏的抗氧化酶水平使其特别容易受到自由基损伤［11］，因此最常见的检测指标为 NO、MDA的含量及NOS、SOD的活性。研究表明Aβ沉积和神经纤维缠结是AD的主要发病机制［12］，氧自由基能促进Aβ聚积和神经纤维缠结，并且同时Aβ也伴随着生成更多的氧自由基，这便直接导致了大量神经元细胞丢失。D-半乳糖在机体内代谢产物为半乳糖醇，不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响细胞的正常渗透压，导致细胞肿胀，功能代谢紊乱，动物随之产生行动迟缓，在此基础上给予Aβ加重了多方面因素导致的学习记忆能力的下降。MDA水平反映脂质过氧化的程度，SOD将超氧自由基转化为过氧化氢，进而在过氧化氢酶的存在下继续分解为水和氧气，因此SOD和过氧化氢酶构成第一个抗活性氧的防御机制。本实验室前期研究发现，由Aβ诱发的AD模型大鼠脑内兴奋性氨基酸含量升高，过度激动N-甲基-D-天冬氨酸 （NMDA）受体，大量 Ca2＋内流，导致细胞内Ca2＋超载，激活NOS，引起NO大量释放。NO不仅是参与学习记忆过程的主要递质之一，而且还有很强的神经毒性作用。实验结果显示Aβ致使体内NO与NOS表达异常，有可能是痴呆形成的重要病理机制之一。本研究结果表明，与模型组相比，ECH中、高剂量组对所检测的4项指标均有不同程度的改善。ECH可以提高AD大鼠皮质、海马组织中SOD的活性，降低MDA含量，减少NO、NOS生成的结果，提示ECH具有增强机体清除自由基的能力，可以对大鼠大脑海马组织内注射Aβ25-35诱发的氧化损伤有较好的保护作用。

ECH能够明显提高学习记忆能力，其机制可能与抵抗了D-半乳糖引起的大鼠海马组织中淀粉样沉淀沉积所带来的不良影响，并促进氧自由基清除，减少氧自由基损伤引起的细胞变形及丢失有关。但ECH其他方式的脑保护作用机制尚需做更深入的研究。

Tab 2 SOD and NOS activity，NO and MDA level in cerebral cortex of rats（±s，n＝10）

Tab 2 SOD and NOS activity，NO and MDA level in cerebral cortex of rats（±s，n＝10）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Treatment group Dose/mg·kg-1 SOD/kU·g-1 MDA/μmol·g-1 NO/μmol·g-1 NOS/kU·g-1 Sham - 46.73±4.12 2.01±0.12 3.60±2.35 0.88±0.16 Model - 18.32±2.56＃＃ 2.88±0.15＃＃ 8.77±3.14＃ 2.90±0.20＃＃ECH-L 10 24.66±1.19 2.72±0.31 6.06±2.53 2.28±0.27*ECH-M 20 38.25±4.60** 2.48±0.26* 4.22±3.05 1.73±0.57**ECH-H 40 43.79±3.42** 2.30±0.24** 4.01±2.39* 1.10±0.25**Hup-A 0.02 45.21±5.30** 2.14±0.12** 3.93±2.59* 1.09±0.29**

Tab 3 SOD and NOS activity，NO and MDA level in hippocampus of rats（±s，n＝10）

Tab 3 SOD and NOS activity，NO and MDA level in hippocampus of rats（±s，n＝10）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Treatment group Dose/mg·kg-1 SOD/kU·g-1 MDA/μmol·g-1 NO/μmol·g-1 NOS/kU·g-1 Sham - 59.66±7.34 2.80±0.23 15.88±2.97 1.40±0.19 Model - 34.13±6.85＃＃ 4.40±0.17＃＃ 29.63±2.03＃＃ 3.65±0.13＃＃ECH-L 10 41.97±4.18 3.99±0.25* 23.17±3.11* 3.31±0.21 ECH-M 20 50.52±2.91** 3.48±0.29** 19.67±2.85** 3.07±0.32*ECH-H 40 56.81±2.84** 3.12±0.18** 16.96±2.30** 1.65±0.28**Hup-A 0.02 58.69±5.26** 3.05±0.11** 16.33±2.37** 1.53±0.66**

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