黄晓佳，李 静，许 潇，李永金

（江苏大学基础医学与医学技术学院药理学系，江苏镇江 212013）

星形胶质细胞是大脑神经细胞中比例最高的一种神经细胞，对神经元可起到营养、支持、清除毒性氨基酸而保护神经元的作用［1-2］。近年来研究表明，在中枢神经系统发生损伤时，星形胶质细胞可产生并分泌许多炎症介质，如细胞因子和趋化因子，继而调节神经元的功能［3-4］。在脑损伤后的恢复期，星形胶质细胞可被激活而增殖，产生胶质疤痕，该作用也与其分泌的活性物质有关。

近年来，研究发现一种趋化因子：间质细胞来源因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在神经系统中具有一定的功能，参与了一些神经系统疾病的发生过程，如急性脑缺血、外伤性脑损伤、大脑感染等。SDF-1最初在B细胞中被发现，对T淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等具有趋化作用［5-6］。根据基因剪切的不同，SDF-1有二种异构体：SDF-1α和SDF-1β［6］。SDF-1氨基酸序列在各物种间高度保守，人和小鼠的SDF-1α和SDF-1β蛋白氨基酸序列分别有99%和97%的相似度［7］。除对血液系统的作用，SDF-1也可调节心脏细胞、血管内皮细胞的功能，具有促进细胞增殖的作用。SDF-1通过与其受体结合发挥作用，其受体包括CXCR-4和CXCR-7。CXCR-4受体参与了肿瘤细胞的生长、迁移、浸润等过程［8］；CXCR-7受体表达于造血系统、心脏、血管、骨骼、肾脏等处，其对SDF-1的结合力高于CXCR-4受体［9-10］。在中枢神经系统，SDF-1及其受体CXCR-4和CXCR7在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、施旺细胞中均有表达，可调节神经递质和一些激素的释放［11］。但SDF-1对星形胶质细胞具有哪些作用，其作用产生的分子机制目前仍不明确。

在本实验中，我们采用原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞作为工具，用重组人SDF-1α进行刺激，观察SDF-1α对星形胶质细胞的作用，并研究其作用的相关分子信号通路。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 新生大鼠（出生24 h以内）来自于江苏大学实验动物中心，高糖DMEM细胞培养基、青霉素、链霉素购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。重组人SDF-1α购自美国R＆D公司；胰酶、台盼蓝染液、细胞裂解液购自美国Sigma公司；溴化去氧尿苷（5-bromo-2′-deoxyuridine，BrdU）和小鼠抗 GFAP单克隆抗体购自美国Sigma公司；小鼠抗BrdU单克隆抗体购自美国B＆D公司；Alexa488和Alexa594结合兔抗小鼠荧光二抗均购自美国Jackson Immuno Research公司；钙离子荧光探针（Fluo-3/AM）购自美国Molecular Probe公司；兔抗细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2单克隆抗体（No.4695）、兔抗磷酸化ERK1/2单克隆抗体（No.4376）购自美国Cell Signaling Technology公司；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购自上海康城生物试剂有限公司。细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。细胞RNA提取试剂盒（RNeasymini kit）、大鼠 Cylin A2、Cyclin B1、Cyclophillin引物均购自美国Qiagen公司。cDNA逆转录试剂盒和定量PCR试剂盒均购自美国ABI公司。定量PCR仪为美国ABI公司产品，激光共聚焦显微镜Zeiss LSM-510为德国Zeiss公司产品。

1.2 细胞培养 按照文献方法稍作修改，进行大鼠皮质星形胶质细胞的分离和培养［12］。将出生24 h内的新生大鼠断颈，剥离脑膜，去除小脑和延脑，将大脑皮层捣碎后加入0.25%胰酶于37°C消化15 min。将吹打后的细胞悬液过100目金属筛，将含细胞的滤液培养于含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素和2 mmol·L-1谷氨酰胺的高糖DMEM中。培养24 h后，换液以去除非贴壁细胞，此后每周更换2次培养液。于12 d后，将培养瓶至于37℃恒温摇床上以200 r·min-1振摇过夜，去除小胶质细胞和少突胶质细胞等混杂细胞。将贴壁细胞消化种于培养板中进行后续实验。此细胞经胶质细胞酸性蛋白抗体免疫组化染色鉴定后，95%以上的细胞为星形胶质细胞。

1.3 细胞计数 将星形胶质细胞以2×108·L-1密度种植于24孔板上，以含0.5%血清培养进行细胞周期同步化48 h，之后以不同浓度SDF-1α进行处理。48 h后消化细胞，以0.4%台盼蓝染液进行染色和细胞计数。

1.4 细胞增殖检测 将星形胶质细胞种植于玻璃片上，加入BrdU作用12 h，冷甲醇固定5 min，吹干后以PBS洗涤3次。加入抗BrdU抗体（1∶5）和抗GFAP抗体（1∶600）于4℃孵育过夜，PBS洗涤后与荧光二抗（1∶800）于室温下作用1 h，用荧光显微镜拍照观察阳性细胞，每张玻璃片选取5个不同视野，至少选取10 000个细胞，以阳性细胞占总细胞数的比例作为数据。

1.5 细胞内钙离子测定 在贴壁细胞培养液中加入荧光离子探针Fluo-3/AM（终浓度为10μmol·L-1），在37℃下避光孵育 40 min。之后，用 Hank′s溶液将细胞洗涤3次以去除多余的Fluo-3，以激光共聚焦显微镜扫描细胞，激发光波长为488 nm，发射光为550 nm，连续扫描400次，扫描频率为2 s/次。给药前扫描30次，给予相应药物后继续扫描。使用ZEISS-SP2软件计算钙离子荧光强度。以各个时间点荧光强度与初始荧光强度比值作为细胞内钙离子浓度［Ca2＋］i的相对值。

1.6 W estern blot检测 各组细胞经处理后，以PBS吹打收集，加入细胞裂解液裂解细胞，以10 000×g于4℃离心20 min，取上清作为蛋白质样本。配制10%的SDS-PAGE胶，以30μg蛋白质上样进行蛋白质电泳。电泳结束后电转于醋酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉于室温下封闭1 h，于4℃与一抗（anti-ERK抗体1∶2 000，anti-ERK抗体1∶3 000，anti-GAPDH抗体1∶5 000）反应过夜，经洗涤后于室温下与相应二抗反应1 h。进行ECL发光反应使底片曝光，扫描蛋白质条带灰度值并进行分析。

1.7 细胞周期检测 将星形胶质细胞按2×108·L-1密度接种于6孔板，经处理24 h后收集细胞，冷PBS洗涤2次，加入1 ml预冷70%乙醇中于4℃固定过夜，离心后弃上清。按照试剂盒说明书加入PI染色液（含 RNase A），混匀，于37℃避光孵育30 min后进行流式细胞仪检测。

1.8 细胞周期蛋白基因表达检测 采用试剂盒提取细胞总mRNA，并采用DNA酶I进行消化。mRNA经纯化后进行逆转录成cDNA，进行定量RTPCR检测。用Cyclophillin基因作为内参，以mRNA相对表达量作为指标。

1.9 统计学检验 实验数据以¯x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析。

Fig 1 Effects of SDF-1αon cell proliferation in rat astrocytes（¯±s，n＝6）A：Representative image of BrdU/GFAP double staining in astrocytes after 48 h-SDF-1αchallenge；B：Cell counting analysis revealsastrocytes underwent proliferation at48 h after the treatmentwith SDF-1α；C：BrdU incorporation assay shows the increased DNA synthesis in astrocytes after the treatmentwith SDF-1αfor 48 h.The arrows indicate the BrdU＋nuclei.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.Bar in A＝25μm.

2 结果

2.1 SDF-1α对星形胶质细胞增殖的作用 在本实验中，采用细胞计数实验测定细胞增殖。如Fig 1所示，星形胶质细胞经血清饥饿48 h后，以不同浓度的 SDF-1α处理 48 h，SDF-1α（10～40 nmol·L-1）可明显的促进星形胶质细胞的增殖，而5 nmol·L-1SDF-1α对星形胶质细胞没有作用。同时，BrdU参入实验也证明，SDF-1α（10～40 nmol·L-1）可剂量依赖性地增加星形胶质细胞的DNA合成。

2.2 SDF-1α对细胞内钙离子浓度的作用 趋化因子可通过激活其受体导致细胞内钙离子浓度增加，并诱导相关生化反应。本实验中，通过使用钙离子荧光探针，测定了SDF-1α对星形胶质细胞细胞内钙离子浓度的作用。如Fig 2所示，静息状态下，星形胶质细胞内钙离子浓度处于稳定的状态，加入SDF-1α（20 nmol·L-1）后，细胞内钙离子浓度明显增加，约20 s后达到峰值，后逐渐降低至正常水平。而溶剂对照组细胞钙离子浓度无明显变化。

Fig 2 Effect of SDF-1αon intracellular calcium concentration in astrocytesThe intracellular calcium concentration in astrocytes was increased，with a peak at10 s after SDF-1αchallenge

2.3 SDF-1α对细胞ERK信号的作用 在细胞增殖的过程中，ERK信号通路发挥了重要的作用。在神经胶质母细胞瘤中，SDF-1α通过激动其受体而导致了 ERK1/2的磷酸化，继而促使细胞发生增殖［13］。在本实验中，通过 Western blot的方法检测了ERK1/2的磷酸化。如Fig 3所示，静息状态下星形胶质细胞低表达磷酸化ERK1/2，而20 nmol·L-1SDF-1α可明显提高ERK1/2的磷酸化水平，该作用从10 min开始，持续至60 min。

2.4 SDF-1α对细胞周期的作用 通过用流式细胞仪对细胞周期的检测，如Fig 4A所示，对照组细胞95%处于G0期；20 nmol·L-1SDF-1α可明显增加处于S期和G2/M期的细胞，促使细胞由G0期进入了S期和M期。

2.5 SDF-1α对细胞周期蛋白基因表达的作用 细胞周期蛋白对细胞周期的调控具有重要的作用，在细胞周期转化过程中发挥了调控功能。在细胞进入S期后，cyclin表达发生变化，促进细胞进入下一个细胞周期。通过定量RT-PCR检测，如Fig 4B所示，经20 nmol·L-1SDF-1α处理48 h后，Cyclin A2、Cyclin B1的基因表达明显增加。

Fig 3 Effects of SDF-1αon the phosphorylation of ERK1/2 in astrocytes±s，n＝4）After treatment with SDF-1α，the expression of pERK1/2 was increased，lasting from 10 min to 60 min.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Fig 4 Effects of SDF-1αon the cell cycle transition and expressions of Cyclin A2 and Cyclin B1 in astrocytes（±s，n＝4）After the treatmentwith SDF-1αfor 48 h，the percentage of the astrocytes in S phase and M phase was increased；A：ThemRNA expressions of Cyclin A2 and Cyclin B1 were induced by the treatmentwith SDF-1αfor 48 h as well B：**P＜0.01 vs control.

3 讨论

本研究表明，外源性给予SDF-1α可明显促进原代培养大鼠星形细胞增殖。同时，SDF-1α可促进钙离子内流，激活细胞内ERK信号通路，使细胞周期由G0期进入S期和M期；细胞周期相关蛋白Cylin A2和Cyclin B1的基因表达也上调。这些结果表明，SDF-1α可通过促进钙离子内流，使ERK信号通路激活，导致细胞进入DNA合成期和细胞分裂期，从而使细胞增殖。该结果与文献报道的结果相一致，提示SDF-1α具有生长因子样作用，可促进细胞增殖。

在与细胞增殖有关的细胞通路中，ERK1/2通路具有重要的作用。ERK1/2在细胞内广泛表达，可被具有有丝分裂原样作用的因子，如细胞因子和趋化因子所磷酸化。被磷酸化激活后，ERK1/2可磷酸化一系列底物，包括蛋白激酶、受体、细胞骨架蛋白和转录因子，从而产生调节细胞增殖的作用［14-15］。使用反义寡核苷酸或抑制剂抑制ERK1/2的表达可起到抑制细胞增殖的作用，如成纤维细胞、T细胞、平滑肌细胞、干细胞和血管内皮细胞［14］。相反，在细胞内上调ERK1/2的活性则可减低细胞对生长因子的依赖性，并促进其增殖［16］。本实验结果也表明，星形胶质细胞经SDF-1α刺激后，细胞内ERK1/2迅速被磷酸化，进而导致细胞增殖，进一步证实了ERK1/2在细胞增殖中的作用［17］。

此外，ERK1/2通路也可调节细胞周期转变过程。静息状态下，ERK存在于细胞质内，呈无活性状态。当受到促有丝分裂因子刺激后，ERK1/2迅速被磷酸化，继而在后续的数小时内呈现出高活性状态，直到G1后期［18］。ERK信号被激活后，Cyclin D1表达上调，Cyclin A2和Cyclin B1的表达也增高，共同起到促进细胞周期转变的作用［19］。ERK1/2也可转移至细胞核内，促进与细胞周期转变有关的转录因子的表达，从而促进细胞生长周期的转变［20］。本实验结果也表明，SDF-1α可促进星形胶质细胞由G0期向S期和M期转变，同时Cyclin A2和Cyclin B1的基因表达也出现增高。

目前，研究已证实，SDF-1α不仅可通过调节造血细胞的功能，如促进前体细胞迁移和B淋巴细胞前体细胞增殖；还具有调节神经系统细胞增殖和迁移的作用，如促进小脑神经细胞的迁移，促进小胶质细胞的增殖［11］。CXCR4受体阻断药 AMD3100可阻断SDF-1所引发的细胞迁移和增殖的作用，表明SDF-1α的作用可能由CXCR4受体所介导［21］。同时，SDF-1通过激动CXCR4受体，使脑胶质瘤细胞增殖，CXCR4受体在脑胶质瘤细胞中高表达，和肿瘤恶性程度正相关［12］。这些结果均表明SDF-1通过其受体调节了部分神经和肿瘤细胞的增殖和迁移。近年来部分研究表明，CXCR4和CXCR7受体可产生二聚体，其作用可能会部分重合，甚至相互干扰［22］。CXCR4激活后可导致细胞内钙离子浓度升高，而CXCR7却不具备该作用，提示需采用RNA干扰等高特异性的方法来研究SDF-1受体介导的生理学效应。本实验结果也表明，SDF-1α可促进星形胶质细胞钙离子内流，推测可能是由CXCR4受体介导了该效应，在今后的研究中该问题将得到进一步验证和阐明。

综上，本实验结果表明，SDF-1α可增加原代培养大鼠星形胶质细胞细胞内钙离子浓度，磷酸化ERK1/2蛋白，促使细胞进入S期和M期，并可促进细胞周期相关蛋白如Cyclin A2和Cyclin B1的基因表达，具有明显促细胞增殖的作用。该结果提示，SDF-1α可能调节了中枢神经系统损伤后胶质细胞增生的过程。

参考文献：

［1］ Blackburn D，Sargsyan S，Monk P N，et al.Astrocyte function and role in motor neuron disease：a future therapeutic target［J］？Glia，2009，57（12）：1251-64.

［2］ Vangeison G，Carr D，Federoff H J，et al.The good，the bad，and the cell type-specific roles of hypoxia inducible factor-1 alpha in neurons and astrocytes［J］.JNeurosci，2008，28（8）：1988-93.

［3］ RitzM F，Hausmann ON.Effect of17beta-estradiol on functional outcome，release of cytokines，astrocyte reactivity and inflammatory spreading after spinal cord injury in male rats［J］.Brain Res，2008，1203：177-88.

［4］ 牛 非，胡金风，苑玉和，等.星形胶质细胞在脑缺血中的变化和作用［J］.中国药理学通报，2011，27（10）：1342-5.

［4］ Niu F，Hu JF，Yuan Y H，etal.Change and role of astrocyte in cerebral ischemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（10）：1342-5.

［5］ Ma Q，Jones D，Borghesani P R，et al.Impaired B-lymphopoiesis，myelopoiesis，and derailed cerebellar neuronmigration in CXCR4-and SDF-1-deficient mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（16）：9448-53.

［6］ Yang S，Pham L K，Liao CP，et al.A novel bonemorphogenetic protein signaling in heterotypic cell interactions in prostate cancer［J］.Cancer Res，2008，68（1）：198-205.

［7］ Shirozu M，Nakano T，Inazawa J，et al.Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-derived factor 1（SDF1）gene［J］.Genomics，1995，28（3）：495-500.

［8］ Balkwill F.The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4［J］.Semin Cancer Biol，2004，14（3）：171-9.

［9］ Gerrits H，Van Ingen Schenau D S，Bakker N E，et al.Early postnatal lethality and cardiovascular defects in CXCR7-deficient mice［J］.Genesis，2008，46（5）：235-45.

［10］Balabanian K，Lagane B，Infantino S，etal.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes［J］.JBiol Chem，2005，280（42）：35760-6.

［11］Odemis V，Boosmann K，Heinen A，et al.CXCR7 is an active component of SDF-1 signalling in astrocytes and Schwann cells［J］.JCell Sci，2010，123（Pt7）：1081-8.

［12］Huang X J，ZhangW P，LiC T，etal.Activation of CysLT receptors induces astrocyte proliferation and death after oxygen-glucose deprivation［J］.Glia，2008，56（1）：27-37.

［13］Barbero S，Bonavia R，Bajetto A，et al.Stromal cell-derived factor 1alpha stimulates human glioblastoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinases 1/2 and Akt［J］.Cancer Res，2003，63（8）：1969-74.

［14］Meloche S，Pouyssegur J.The ERK1/2 mitogen-activated protein kinase pathway as amaster regulator of the G1-to S-phase transition［J］.Oncogene，2007，26（22）：3227-39.

［15］Yoon S，Seger R.The extracellular signal-regulated kinase：multiple substrates regulate diverse cellular functions［J］.Growth Factors，2006，24（1）：21-44.

［16］Cheng M，Sexl V，Sherr C J，etal.Assembly of cyclin D-dependent kinase and titration of p27Kip1 regulated bymitogen-activated protein kinase kinase（MEK1）［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（3）：1091-6.

［17］高丽昌，李婷婷，唐 禄，等.ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用［J］.中国药理学通报，2011，27（10）：1405-5.

［17］Gao LC，Li T T，Tang L，etal.Role of ERK-1/2 signaling pathway in keratinacyte growth factor-2 stimulating human keratinocyte proliferation［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（10）：1405-5.

［18］Yamamoto T，Ebisuya M，Ashida F，et al.Continuous ERK activation downregulates antiproliferative genes throughoutG1 phase to allow cell-cycle progression［J］.Curr Biol，2006，16（12）：1171-82.

［19］Zhang W，Liu H T.MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation inmammalian cells［J］.Cell Res，2002，12（1）：9-18.

［20］Lidke D S，Huang F，Post JN，et al.ERK nuclear translocation is dimerization-independent but controlled by the rate of phosphorylation［J］.JBiol Chem，2010，285（5）：3092-102.

［21］Folkins C，Shaked Y，Man S，etal.Glioma tumor stem-like cells promote tumor angiogenesis and vasculogenesis via vascular endothelial growth factor and stromal-derived factor1［J］.Cancer Res，2009，69（18）：7243-51.

［22］Levoye A，Balabanian K，Baleux F，et al.CXCR7 heterodimerizeswith CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling［J］.Blood，2009，113（24）：6085-93.