陈 萍，原 琴，姜 熙，伍娟英，黄慧芳

（福建省血液病研究所，福建省血液病学重点实验室，福建医科大学附属协和医院，福建福州 350001）

CD44属于黏附分子家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，根据所含外显子类型不同可将CD44分为两类：由10个组成型外显子编码的标准型CD44（CD44s）和10个变异型外显子选择性地进行剪切产生的变异型CD44（CD44v）。在正常造血过程中，CD44已被证实参与正常髓系分化及多种细胞－细胞和细胞－胞外基质的相互作用，并且具有信号分子的功能［1］。近年来大量研究表明 CD44，尤其是 CD44v与造血系统恶性肿瘤如急／慢性白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤等，特别是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）有密切联系［2－4］。Bendall等［4］比较了30例AML患者白血病细胞与正常外周血单个核细胞（PBMC）及骨髓（BM）CD34＋造血干细胞CD44变异体的表达情况，结果发现，AML细胞的CD44变异体的组合方式较正常造血祖细胞更为复杂。此外，AML病人高表达CD44-6v还提示其预后欠佳［5］。A3D8（IgG1）是一种鼠源性的抗 CD44单克隆抗体，可与CD44膜外区糖蛋白结合，通过抑制c-Jun启动子的活性，下调c-Jun的表达或稳定细胞内p27Kip1水平诱导各个亚型的AML细胞发生分化和凋亡［6－7］。

IL-3Rα即IL-3受体α亚基，被认为是AML干细胞（AML-LSCs）的一个独特标志，在正常造血干细胞极少表达。体外研究表明，IL-3Rα高表达可以提高细胞对IL-3的敏感性，从而激活下游的PI3K／Akt等信号通路，传递生存信号，有利于形成IL-3非依赖的克隆或在极低剂量IL-3的刺激下即能增殖。临床研究发现，在AML患者中，高表达IL-3Rα与高白细胞数、高原始细胞和预后差有关，通过检测IL-3Rα的水平可以判断白血病细胞增殖状况，对缓解后的AML患者进行复发率和生存率的预测［8］。已有学者认为，针对IL-3Rα的靶向治疗可清除AML干细胞［9］。但迄今为止对于CD44单抗A3D8能否调节IL-3Rα及下游信号通路的表达未见报道。本研究以急性早幼粒细胞株NB4细胞为研究对象，探讨A3D8对IL-3Rα及下游PI3K／Akt信号通路的表达调节。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养条件 人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4由福建医科大学附属协和医院检验科郑培烝博士惠赠。细胞培养条件：含10%FBS（天津灏洋生物）常规剂量青、链霉素的RPMI 1640培养液（Gibco公司），37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2 d半量换液，取对数生长期且细胞存活率（台盼蓝拒染法）＞95%的细胞进行实验。

1.2 药物 CD44单抗 A3D8（C7923）购自 Sigma公司。由于A3D8原液中含有的叠氮化钠会非特异杀伤细胞，使用前应将其用10k超滤管（Millipore公司）8 000×g，5min离心数次后，将超滤管管芯反向放入一新的套柱中，1 000×g，5 min离心数次后得到纯化的A3D8。同型对照的鼠IgG1抗体购自广州英韦创津公司，临用前用PBS稀释至所需浓度。LY294002配制：LY294002购自CST公司，用DMSO溶解成10 mmol·L－1保存，RPMI 1640培养液稀释至即用浓度。

1.3 实时定量 RT-PCR检测 NB4细胞 IL-3Rα mRNA表达 收集A3D8与同型对照处理后的NB4细胞，用TRIzol法提取总RNA，准确定量后反转录为cDNA（Promega公司），再采用SYBR Green（BD公司）进行定量 PCR。反应体系：2×SYBR Green Master（ROX）12.5μl，上下游引物终浓度为 0.2 μmol·L－1，cDNA 2.5μl，RNase-free water加至 25 μl。引物序列如下：β-actin正向引物 5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAA-3′，反 向 引物 5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；IL-3Rα 正 向 引 物5′-GACCTGTACTTGAACGTTGCC-3′，反向引物 5′-GAAACGACACCCGATACGTGT-3′。扩 增 条 件 为95℃预变性 10 s；95℃，15 s；55℃，10 s；40个循环；68℃，20 s。以 β-actin为内参，采取 2－ΔΔCT相对定量分析各基因的变化情况。

1.4 Western blot检测 NB4细胞中 IL-3Rα蛋白表达及PI3K／Akt信号通路的变化 收集分别经A3D8与同型对照处理后的2×106个NB4细胞，经匀浆裂解后，离心收集上清，用Brandford法定量。各取40μg总蛋白，用SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，室温下封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，洗涤后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，进行化学发光法反应。抗β-actin单抗为Santa Cruz公司产品；抗IL-3Rα单克隆抗体购自 Abcam公司；抗 Akt、p-AktSer473、抗p-AktThr308、抗p-PDK1单抗均为CST公司产品，抗鼠二抗及抗兔二抗购自CST公司。

1.5 PI3K／Akt信号通路抑制剂 LY294002联合A3D8对NB4细胞增殖及凋亡的影响 NB4细胞按1×104／孔接种入96孔板，分别设置 LY294002处理组（10μmol·L－1）、A3D8（4 mg·L－1）处理组及二者联合组，每组设3个平行孔，置于细胞培养箱中孵育48 h，采用 MTT比色法检测，具体见文献［6］。抑制率／%＝（未处理组OD值－实验组OD值）／未处理组OD值×100%。细胞凋亡采用Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术，收集细胞，按Annexin-V-FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司）说明书操作，在流式细胞仪（BD公司）上检测。

2 结果

2.1 A3D8可下调IL-3RαmRNA的表达 Realtime PCR结果显示，经4 mg·L－1A3D8处理后，IL-3RαmRNA表达水平下降，24、48和72 h分别为对照组的（28.1±3.2）%、（15.4±2.7）%和（16.7±1.9）%，见 Fig 1。

Fig 1 Expression of IL-3RαmRNA in NB4 treated with isotype control or A3D8**P＜0.01 vs control

2.2 A3D8可抑制NB4细胞IL-3Rα蛋白的表达及抑制其下游PI3K／Akt信号通路 4 mg·L－1A3D8作用于NB4细胞24 h后，IL-3Rα蛋白表达下调，p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1蛋白水平下调，见 Fig 2。

Fig 2 Expression of IL-3Rαprotein and level of phosphorylation of Akt in NB4 treated with isotype control or A3D8

2.3 LY294002可增强A3D8对NB4细胞增殖抑制和凋亡的诱导 PI3K／Akt信号通路抑制剂LY294002与A3D8联合，可增强对NB4细胞增殖抑制（Fig 3）及凋亡的诱导（Fig 4）。

2.4 LY294002可增强 A3D8对NB4细胞PI3K／Akt信号通路的抑制 LY294002与A3D8联合可进一步抑制PI3K／Akt信号通路，通路中的信号分子p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1蛋白水平进一步下调（Fig 5）。

3 讨论

CD44是一个跨膜的糖蛋白分子，在许多恶性的实体肿瘤组织如肝癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌等中都有高表达，且表达水平与肿瘤的转移、预后密切相关［10］。近10年来，许多研究表明，CD44对血液肿瘤，特别是AML细胞的增殖、分化、凋亡、耐药发挥着至关重要的作用，并被认为是AML-LSCs的标志之一。因此，运用针对 CD44的单克隆抗体治疗AML成为研究热点［11］。

一系列的研究结果表明，A3D8可抑制各亚型AML细胞的增殖，并能促使AML细胞分化和凋亡。Gadhoum等［7］研究表明，A3D8能够稳定 p27Kip1，增加cyclinE／Cdk2复合物的形成，从而抑制NB4细胞的增殖。IL-3Rα是AML-LSCs的一个独特标志，还有研究认为其可用于监测APL的微小残留病灶。在本课题的前期研究中，我们发现维甲酸（ATRA）无法下调NB4细胞IL-3Rα的表达，而三氧化二砷（As2O3）则能下调［12］。由于 A3D8被证实对耐 ATRA的NB4细胞及耐As2O3的原代APL细胞仍具有杀伤作用，因此，我们推测A3D8可能对NB4细胞的IL-3Rα蛋白也具有抑制作用。我们的结果证实了我们的推测，A3D8诱导NB4细胞分化和凋亡过程中，可以下调IL-3RαmRNA和蛋白水平表达。

Fig 3 Effects of LY294002，A3D8 and LY294002 followed by A3D8 on the proliferation of NB4 cells*P＜0.05 vs LY294002 and A3D8

Fig 4 Effects of LY294002，A3D8 and LY294002 followed by A3D8 on the apoptotic rate of NB4 cells*P＜0.05 vs LY294002 and A3D8

Fig 5 Level of phosphorylation of Akt in NB4 treated with LY294002，A3D8 and LY294002 followed by A3D8

PI3K／Akt信号通路是调控肿瘤细胞增殖、分化与凋亡的重要通路之一，在许多恶性血液病中可以检测到该通路的异常激活［13－15］。同时，该通路也是IL-3Rα分子信号传导中的重要通路。在这一通路中，p-Akt的激活可通过激活下游一系列信号分子从而发挥抗凋亡的作用。我们的研究显示，A3D8作用于NB4细胞24 h后，明显下调PI3K／Akt信号通路上的p-AktSer473、p-AktThr308蛋白水平，抑制该通路。将该通路抑制剂与A3D8联合，可协同抑制NB4细胞增殖，并进一步抑制NB4细胞中该通路的重要信号分子的蛋白水平。PI3K／Akt信号通路是联系AML和骨髓基质细胞的重要通路，IL-3Rα被认为可作为残留APL的标记，这提示我们A3D8可能对阻断APL和基质细胞间的联系，清除骨髓中残留APL细胞发挥作用。

参考文献：

［1］ Ponta H，Sherman L，Herrlich P A.CD44：from adhesion molecules to signaling regulators［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（1）：33－45.

［2］ Akisik E，Bavbek S，Dalay N.CD44 variant exons in leukemia and lymphoma［J］.Pathol Oncol Res，2002，8（1）：36－40.

［3］ Quere R，Andradottir S，Brun A C，et al.High levels of the adhesion molecule CD44 on leukemic cells generate acute myeloid leukemia relapse after withdrawal of the initial transforming event［J］.Leukemia，2011，25（3）：515－26.

［4］ Bendall L J，Bradstock K F，Gottlieb D J.Expression of CD44 variant exons in acute myeloid leukemia is more common and more complex than that observed in normal blood，bone marrow or CD341 cells［J］.Leukemia，2000，14（7）：1239－46.

［5］ Legras S，Günthert U，Stauder R，et al.A strong expression of CD44-6v correlates with shorter survival of patients with acute myeloid leukemia［J］.Blood，1998，91（9）：3401－13.

［6］ Zada A A，Singh SM，Reddy V A，et al.Downregulation of c-jun expression and cell cycle regulatory molecules in acute myeloid leukemia cells upon CD44 ligation［J］.Oncogene，2003，22（15）：2296－308.

［7］ Gadhoum Z，Leibovitch M P，Qi J，et al.CD44：a new means to inhibit acute myeloid leukemia cell proliferation via p27Kip1［J］.Blood，2004，103（3）：1059－68.

［8］ Testa U，Riccioni R，Militi S，et al.Elevated expression of IL-3Rαin acute myelogenous leukemia is associated with enhanced blast proliferation，increased cellularity，and poor prognosis［J］.Blood，2002，100（8）：2980－8.

［9］ Frankel A，Liu J S，Rizzieri D，et al PhaseⅠclinical study of diphtheria toxin-interleukin-3 fusion protein in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplasia［J］.Leuk Lymphoma，2008，49（3）：543－53.

［10］Herold Mende C，Seiter S，Born A I，et al.Expression of CD44 splice variants in squamousepithelia and squamous cell carcinomas of the head and neck［J］.J Pathol，1996，179：662－731.

［11］宋清晓，吴 勇，陈元仲.CD44抗体HI44a对急性髓系白血病细胞株HL-60细胞体外增殖、分化作用的研究［J］.中国药理学通报，2011，27（3）：378－82.

［11］Song Q X，Wu Y，Chen Y Z.The effect of CD44 antibody-HI44a on proliferation and differentiation of HL-60 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（3）：378－82.

［12］Chen P，Wu J Y，Huang H F，Chen Y Z.The effect to IL-3Rα，downstream PI3K／Akt signaling of all-trans retinoic acid and arsenic trioxide in NB4 cells［J］.Pharmazie，2014，69（4）：297－300.

［13］Osaki M，Oshimura M，Ito H.PI3K-Akt pathway：its functions and alterations in human cancer［J］.Apoptosis，2004，9（6）：667－76.

［14］Xu Q，Simpson SE，Scialla TJ，et al.Survival of acute myeloid leukemia cells requires PI3 kinase activation［J］.Blood，2003，102（3）：972－80.

［15］Kubota Y，Ohnishi H，Kitanaka A，et al.Constitutive activation of PI3K is involved in the spontaneous proliferation of primary acute myeloid leukemia cells：direct evidence of PI3K activation［J］.Leukemia，2004，18（8）：1438－40.