齐 鹏，延光海，祝家彬，刘尚勇，朴红梅

（1.延边大学附属医院呼吸内科，吉林延吉 133000；2.延边大学医学院，吉林 延吉 133002）

肺纤维化是以呼吸功能永久性丧失为结局的严重危害人类健康的呼吸道疾病，目前，尚无特效的药物。Pyrin是具有抑制NF-κB激活的重要蛋白，我们曾报道Pyrin重组蛋白能有效地抑制支气管哮喘气道周围组织纤维化等气道组织重建，而其在肺纤维化中的作用尚未见报道［1］。在本研究中，我们用博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型，气道内给予Pyrin重组蛋白，观察了肺组织中 NF-κB p65、TGF-β1、CTGF的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料 健康清洁级♀ BALB／c小鼠30只，体质量（18±5）g，由延边大学动物中心提供，合格证号：SCXK（吉）2011－0007；Pyrin重组蛋白质由日本岩手医科大学山内广平教授提供；博莱霉素购自哈尔滨博莱制药有限公司；NF-κB p65、TGF-β1、CTGF抗体以及 PCR试剂盒为美国 Santa Cruz公司产品；RT-PCR仪（MJ Research Co，美国）；电泳仪及电泳槽（E-C Apparatus Corporation，美国）；Western blot转膜仪（BioRad公司）。

1.2 方法

Tab 1 Changes of TGF-β1，CTGF，NF-κB p65 mRNA，protein expression in lung tissues（±s，n＝10）

Tab 1 Changes of TGF-β1，CTGF，NF-κB p65 mRNA，protein expression in lung tissues（±s，n＝10）

＃P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs bleomycin group

Group TGF-β1mRNA CTGF mRNA TGF-β1 protein CTGF protein NF-κB p65 protein Control 0.03±0.2 0.12±0.5 0.11±0.2 0.07±0.20.13±0.3 Bleomycin 0.92±0.5＃ 0.73±0.6＃ 0.84±0.5＃ 0.86±0.7＃ 0.78±0.5＃Bleomycin＋Pyrin 0.25±0.2* 0.36±6.5* 0.51±0.3* 0.35±0.5* 0.53±0.3*

1.2.1 分组 按随机数字表法，分为3个组，即①组为正常对照组、②组为肺纤维化模型组、③组为Pyrin重组蛋白治疗组，每组10只。

1.2.2 造模 ①组气管内注入0.5 ml生理盐水；②、③组气

管内注入0.5 ml生理盐水稀释的博莱霉素（每千克体重5 mg）1次，建立肺纤维化小鼠模型；③组于博莱霉素灌注前1天，以后每隔1天气道内注入Pyrin重组蛋白50μg·kg－1体重，①和②组气道内注入等量生理盐水。3个组动物均于d 14全麻下取右肺组织，放入液氮中速冻，－80℃保存。

1.3 组织病理学检查 肺组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，行4μm厚病理切片。经苏木精－伊红（HE）染色及Masson三色染色观察小鼠肺组织病理学结构改变。

1.4 RT-PCR检测 根据参考文献［1］，检测肺组织中 TGF-β1、CTGF的 mRNA表达。

1.5 Western blot检测 根据参考文献［1］，检测肺组织 NF-κB p65、TGF-β1、CTGF蛋白表达。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学处理，各组数据均采用±s表示，方差齐采用单因素方差分析，方差不齐用非参数检验。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变 光镜下观察HE染色结果显示：对照组肺组织无明显改变；模型组可见肺泡腔内有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺间质内成纤维细胞、胶原纤维明显增多，肺泡间隔增宽，肺泡结构破坏，肺泡腔明显缩小，肺泡萎陷或消失，肺间质出现大量胶原纤维和成纤维细胞；Pyrin重组蛋白干预组与模型组比较，上述变化明显减轻。

2.2 Pyrin重组蛋白对肺组织胶原沉积的影响 Masson三色染色提示，对照组肺组织含有少量的胶原纤维，而模型组有大量的胶原纤维沉积。Pyrin重组蛋白干预组与模型组相比较明显减轻。

2.3 Pyrin重组蛋白对肺组织 TGF-β1、CTGF mRNA表达的影响 模型组TGF-β1、CTGF mRNA含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组 TGF-β1、CTGF mRNA含量明显高于治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见Tab 1。

2.4 Pyrin重组蛋白对肺组织 TGF-β1、CTGF蛋白表达的影响 模型组TGF-β1、CTGF蛋白含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组TGF-β1、CTGF蛋白含量明显高于治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见Tab 1。

2.5 Pyrin重组蛋白对肺组织NF-κB p65表达的影响 模型组小鼠肺组织NF-κB p65的蛋白表达较对照组明显增加（P＜0.05）。治疗组肺组织中NF-κB p65蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.05）。见Tab 1。

3 讨论

大量基础与临床研究提示，肺泡炎是肺纤维化发病的中心环节，它的持续存在与肺组织结构和功能不可逆损伤密切相关，而这种炎症与多种炎性细胞因子、致纤维化因子的过度表达密切相关。NF-κB是调控这些众多炎症因子基因表达的重要调节因子之一［2］，它的激活与肺纤维化的发生及发展密切相关。众所周知，TGF-β1是一种促纤维化细胞因子，是肺纤维化发展中的关键性分子。CTGF是TGF-β1的下游因子，可诱导肌成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，与肺纤维化发生密切相关［3］。在本研究中，我们发现肺纤维化模型组TGF-β1、CTGF的含量明显高于生理盐水对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Pyrin重组蛋白组 TGF-β1、CTGF的含量与肺纤维化模型组相比较明显降低，差异有统计学意义。

目前认为，在NF-κB激活环节中，具有抑制其激活的信息蛋白有Pyrin［4］。我们课题组曾制备出Pyrin重组蛋白，并且发现Pyrin重组蛋白能够通过抑制NF-κB信号通路来阻断TGF-β1和CTGF的过度表达，而抑制哮喘小鼠气道纤维化，进而抑制气道重构的发生［1］。在本研究中，我们发现博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型组肺组织中NF-κB p65的蛋白表达较对照组明显增加（P＜0.05），而Pyrin重组蛋白治疗组肺组织中NF-κB p65蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.05）。

综上所述，我们认为Pyrin重组蛋白可能部分是通过抑制NF-κB信号途径，来阻断TGF-β1和CTGF的过度表达而实现抑制肺泡炎症，进而抑制肺纤维化的形成。

参考文献：

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