罗萧萧，赵以林，李世勇，谭蕾，王金韬

(华中科技大学同济医学院第二临床学院，武汉 430030)

·药物研究·

氯胺酮通过MEF2信号通路调节发育期神经元突触生长及突触重塑*

罗萧萧，赵以林，李世勇，谭蕾，王金韬

(华中科技大学同济医学院第二临床学院，武汉 430030)

目的 探讨氯胺酮不同暴露时间下对发育神经元肌细胞增强因子2(MEF2)信号通路及突触生长相关蛋白synapsin I表达影响。方法新生5 d龄SD大鼠,随机分为2,4,6和24 h氯胺酮组(T组)和对照组(C组)。将新生5 d SD大鼠皮下注射氯胺酮(20 mg·kg-1)干预。对照组不做任何处理。干预后在各对应时间点提取海马神经元总RNA,利用real-time PCR进行定量分析MEF2信号通路(MEF2 mRNA、synGAP I mRNA和Arc mRNA)及突触形成相关基因synapsin I mRNA表达水平。结果与C组相比,用氯胺酮干预后时间依赖性下调海马神经元MEF2 mRNA、synGAP I mRNA、Arc mRNA(P＜0.05)。Synapsin I mRNA表达则时间依赖性上调(P＜0.05)。麻醉后24 h恢复正常。结论氯胺酮短暂下调MEF2信号通路而上调synapsin I表达,其机制可能是Arc表达上调增加突触数目以致synapsin I表达上调。

氯胺酮；海马；发育期神经元；肌细胞增强因子2；突触素

在神经元发育过程中,轴突的分化生长以及突触联系形成是神经系统功能得以体现的基础及记忆形成的关键步骤,而突触素在神经元突起的生长、突触的形成以及突触的维持中发挥重要作用[1-2]。发育期神经元是轴突生长和突出形成的重要阶段,特别容易受到外界因素干扰如氯胺酮等。肌细胞增强因子2 (myocyte enhancer factor 2,MEF2)作为钙依赖性调节因子,在神经系统突触发育和分化中发挥着重要的作用,特别是下游基因synGAP和Arc在调控突触形成过程中起着重要作用[3-4]。笔者在本研究探讨氯胺酮对发育期神经元突触素的表达与MEF2信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 逆转录试剂盒(日本Takara公司,批号:D6110A)；Trizol试剂(上海华舜公司,批号: WR202)；实时定量PCR试剂盒(日本Takara公司,批号:DRRO81S)；BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪(德国Ependorf公司)；ABI实时荧光定量PCR仪(美国Life Technologies公司)；氯胺酮注射剂(福建吉田药业有限公司,规格:2 mL∶100 mg,批号:H35010148)。

1.2 动物选择及分组 出生5 d的Sprague-Dawley (SD)大鼠30只,雌雄不拘,体质量10～13 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。利用随机数字表将实验动物分为5组(n=6):对照组(C组)、氯胺酮2 h组、氯胺酮4 h组、氯胺酮6 h组和氯胺酮24 h组,其中氯胺酮各时间点组统称为T组。将新生5 d SD大鼠皮下单次注射氯胺酮(20 mg·kg-1)干预而对照组不做任何处理。麻醉期间低浓度给氧(氧流量2 L·min-1),35℃干预。麻醉后,在相应时间点断头提取海马组织的总mRNA。

1.3 实时荧光定量PCR 用Trizol试剂盒提取各组海马组织的总RNA,按实时定量RT-PCR试剂盒说明书取500 ng总RNA逆转录合成cDNA,然后用荧光标记物SYBR GreenI在ABI荧光定量PCR仪上进行PCR反应。在同一反应体系内对MEF2、Arc、synGAP I、synapsin I mRNA和内参照β-actin mRNA进行扩增。PCR引物为:MEF2(NM_001014035.1)上游引物为5′-ACG GCA CAC AGA GCA CC TTG-3′,下游引物为5′-CTA GGT TTC TGC AGG CTA ATG TGGA-3′, PCR产物片断为133 bp；Arc(ID:54323)上游引物为5′-GCA CAT AAA CCA TGA CCC ATA CT-3′,下游引物为5′-GCT GGA TAT TGA AGG CTT GG-3′,PCR产物片断为111 bp；synGAP I(NM_001113409.1)上游引物为5′-TGT CCG CTG ACA TCG AGA GTG-3′,下游引物为5′-AGC TTC CGG TTG GAC ATG TGT AG-3′, PCR产物片断为157 bp；synapsin I(NM_019133)上游引物为5′-TCT GA CCA ATG CCT TCA ACC TTC-3′,下游引物为5′-CTG CGG ATG GTC TCA GCT TTC-3′, PCR产物片断为87 bp。β-actin(NM_031144)上游引物为5′-TGA CAG GAT GCA GAA GGA GA-3′下游引物为5′-TAG AGC CAC CAA TCC ACA CA-3′,PCR产物片断为104 bp。扩增参数:94℃变性5 s,60℃退火及延伸30 s,共反应40个循环,分析融解曲线。

2 结果

2.1 氯胺酮对发育期大鼠海马MEF2信号通路的影响 发育期大鼠海马MEF2 mRNA在氯胺酮麻醉2 h时表达开始下调(t=3.83,P＜0.05),4 h时表达最低(t=3.07,P＜0.05)；Arc mRNA(t=3.58,P＜0.05)和synGAP I mRNA(t=3.52,P＜0.05)在氯胺酮处理6 h时表达最低(P＜0.05)。于麻醉后24 h时3种基因mRNA水平表达恢复正常。见表1。故氯胺酮可短暂下调发育期大鼠海马MEF2信号通路。

2.2 氯胺酮对发育期大鼠海马synapsin I mRNA表达的影响 synapsin I mRNA麻醉4 h时表达开始上调(t=-3.28,P＜0.05),6 h时表达达到高峰(t=-2.77,P＜0.05)。于麻醉后24 h时基因synapsin I mRNA水平表达恢复正常。见表2。故氯胺酮可上调发育期大鼠海马synapsin I mRNA表达。

3 讨论

氯胺酮具有镇痛作用显著而呼吸抑制作用较轻的特点,多用于小儿麻醉。研究证实氯胺酮作为N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体非选择性阻断药,可引起发育期神经系统退行性变。其机制可能是氯胺酮阻断NMDA受体,可抑制细胞外钙离子内流,抑制钙/钙调蛋白(Ca2+/CaM)的依赖信号途径,从而抑制环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)和MEF2多种信号通路转录[5]。突触形成期为大脑快速发育期,而NMDA受体活性是神经系统在发育期神经元生长及突触重塑所必需。由于突触形成期神经元对各种麻醉药最为敏感,发育期大鼠神经元发育高峰期为出生后第1～7 d,一般认为第5天是神经元发育的高峰期并开始形成功能性突触连接[6-7]。因此笔者采用5 d龄乳鼠来源的海马神经元,用作发育期海马神经元来探讨氯胺酮对突触生长和突触重塑的影响。

表1 两组大鼠各时间点海马MEF2 mRNA、synGAP I mRNA、Arc mRNA表达水平的比较Tab.1 Comparison of the mRNA expression of MEF2,synGAP I and Arc in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

表1 两组大鼠各时间点海马MEF2 mRNA、synGAP I mRNA、Arc mRNA表达水平的比较Tab.1 Comparison of the mRNA expression of MEF2,synGAP I and Arc in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

与C组同时间点比较,*1P＜0.05Compared with C group at same time point,*1P＜0.05

组别与时间MEF2 mRNAsynGAP I mRNAArc mRNA组别与时间MEF2 mRNAsynGAP I mRNAArc mRNA T组C组2 h0.69±0.09*10.76±0.07*10.70±0.14*12 h1.01±0.101.03±0.050.99±0.09 4 h0.52±0.13*10.61±0.12*10.55±0.21*14 h1.01±0.121.03±0.091.02±0.17 6 h0.66±0.14*10.57±0.17*10.48±0.22*16 h0.99±0.130.98±0.100.98±0.10 24 h1.03±0.041.03±0.190.96±0.08 24 h1.02±0.091.01±0.110.97±0.06

表2 两组大鼠各时间点海马synapsin I mRNA表达水平的比较Tab.2 Comparison of synapsin I mRNA expression in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

表2 两组大鼠各时间点海马synapsin I mRNA表达水平的比较Tab.2 Comparison of synapsin I mRNA expression in hippocampal neurons between two groups at each time point n=3,±s

与C组同时间点比较,*1P＜0.05Compared with C group at same time point,*1P＜0.05

组别2 h4 h6 h24 h T组1.29±0.341.90±0.47*12.46±0.91*11.18±0.57 C组1.06±0.210.96±0.140.99±0.140.98±0.05

MEF2是一种特定的转录因子,因其涉及基因调节不同环节及其控制多种基因表达,正日益受到高度重视[3-4]。目前发现MEF2在发育期神经元中是调节突触生长和突触重塑的重要信号通路。在发育期中枢神经系统,MEF2的激活负调控兴奋性突触密度。MEF2激活依赖于细胞外Ca2+内流。钙离子通过NMDA和电压依赖性钙通道(voltage-dependentcalcium channels,VDCCs)内流,激活钙/钙调蛋白(Ca2+/CaM)的依赖信号途径。然后刺激钙调磷酸酶(也称为蛋白磷酸酶2B)去磷酸化MEF2的蛋白质上一些磷酸化位点,包括对MEF2A的和MEF2D(分别抑制Ser408和Ser444),以促进MEF2的活化。当MEF2被激活,促进了其一系列下游基因转录,包括Arc和synGAP[8]。研究证实Arc是调控发育期海马神经元的突触数目重要基因[3-4]。因此本研究旨在探讨氯胺酮对MEF2信号通路及其下游基因的表达的影响。

Synapsin I是特异性位于轴突末梢的突触前膜上,是一种重要的膜标记蛋白。Synapsin I在发育期神经元生长及突触重塑方面起着非常重要的作用,它参与乙酰胆碱、谷氨酸等神经递质的释放过程。在发育期神经元轴突生长过程中synapsin I调控着轴突分支数目。有研究认为,synapsin I一方面通过对突触结构的影响,另一方面通过其磷酸化作用调节神经递质的释放,从而在突触可塑性中起一定作用[1-2]。笔者研究证实氯胺酮可以上调发育期海马神经元synapsin I表达,这说明氯胺酮可能增加轴突分支的数目有关。

本研究结果表明,发育期大鼠海马MEF2 mRNA、synGAP I mRNA和Arc mRNA在氯胺酮麻醉处理后短暂表达下调,说明氯胺酮能够抑制MEF2信号通路。氯胺酮麻醉处理后发育期大鼠海马synapsin I表达都短暂上调,说明氯胺酮增强对synapsin I表达。

综上所述,氯胺酮可短暂下调MEF2信号通路(MEF2 mRNA、synGAP I mRNA和Arc mRNA)的表达,且上调海马突触形成相关基因synapsin I表达。在氯胺酮作用下MEF2信号通路对synapsin I表达的调节关系,还需进一步实验证实。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.002

Effects of Ktamine on Transcriptional Factor MEF2 Signaling Pathway and Expression of Synaptogenesis Synapsin I of Rat Developing Hippocampal Neurons in vivo

LUO Xiao-xiao,ZHAO Yi-lin,LI Shi-yong,TAN Lei,WANG Jin-tao
(The Second Clinical College of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To investigate the time-dependent effects of ketamine on myocyte enhancer factor 2(MEF2) signaling pathway and expression of synaptogenesis synapsin I of rat developing hippocampal neuronsin vivo.MethodsForty 5-day-old rats were randomly divided into 4 treatment groups receiving ketamine(20 mg·kg-1)single injection and a control group receiving no treatment.Pups were killed by decapitation to extract total RNA from hippocampal neurons in the 4 treatment groups at 2,4,6,24 h,respectively,and from the control group.Real-time-PCR was used to detect the expression of the MEF2 mRNA、synGAP I mRNA and Arc mRNA and synapsin I mRNA after intervention.ResultsCompared with the control group, there are significant decreases in the expression of MEF2 mRNA,synGAP I mRNA,Arc mRNA and increase in synapsin I mRNA of the neurons from ketamine treatment groups(P＜0.05).ConclusionThe mechanism of ketamine-induced decrease in expression of MEF2 signaling pathway and increase in the expression of synapsin I may be related to decreased expression of Arc signaling pathway,which in turn regulates the expression of snapsin I in the developing hippocampal neurons.

Ketamine;Hippocampus;Developing neuron;Myocyte enhancer factor 2;Synapsin I

R971.2;R965

A

1004-0781(2014)04-0419-03

2013-05-02

2013-10-25

*国家自然科学基金资助项目(81200880)

罗萧萧(1992-),女,湖北武汉人,学士,研究方向:麻醉药理。电话:(0)13507122565,E-mail：asd2007asd@126.com。

赵以林(1982-),男,山东日照人,医师,博士,研究方向:麻醉毒理。电话:(0)13871469616,E-mail：yilinzhao001@163.com。