李新新，杨秀丽，陈晓雷，郝伟，王一然

(沈阳医学院 1.法医司法鉴定所；2.机能实验中心，沈阳 110034；3.辽宁省法库县公安局，法库 110400)

Caspase-3抑制药对甲基苯丙胺依赖大鼠脑组织NO和SOD及MDA的影响*

李新新1，杨秀丽1，陈晓雷1，郝伟2，王一然3

(沈阳医学院 1.法医司法鉴定所；2.机能实验中心，沈阳 110034；3.辽宁省法库县公安局，法库 110400)

目的 观察Caspase-3抑制药对甲基苯丙胺(MA)慢性依赖大鼠脑组织损伤的干预与保护作用。方法建立MA慢性依赖大鼠实验动物模型,侧脑室注射Caspase-3抑制药(z-DEVD-fmk),检测各组大鼠脑组织海马区一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的变化及三者之间的关系。结果MA慢性依赖组脑组织海马区NO、MDA明显升高,SOD含量减少;MA+z-DEVD-fmk干预组NO、MDA含量升高减少,SOD活性下降减弱,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论Caspase-3抑制药能够降低MA慢性依赖大鼠脑组织海马区NO、MDA含量,并使SOD含量升高,对大鼠脑组织损伤有一定的干预与保护作用。

甲基苯丙胺；Caspase-3抑制药；一氧化氮；超氧化物歧化酶；丙二醛

甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)属于苯丙胺类兴奋剂,长期滥用可引起中枢神经系统神经化学、神经病理和行为的改变,对动物及人类大脑多巴胺(dopamine,DA)或5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能神经元具有毒性作用〔1〕。笔者在本实验中通过建立MA慢性依赖动物模型,观察在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3)抑制药z-DEVD-fmk干预下大鼠脑组织中一氧化氮(nitric oxide,NO)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化及相互关系,为进一步探索MA依赖的干预和治疗提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD大鼠(沈医动物质量合格证号: 0008180),体质量180～230 g,雌雄各半,均由沈阳医学院实验动物研究中心提供,许可证号:SCXK(辽) 2010-0001。

1.2 药品与试剂 MA由丹东市公安局提供(纯度: 70%)；Caspase-3抑制药z-DEVD-fmk购于德国默克公司(批号:DOO99483)；NO试剂盒(批号:20110709)、SOD试剂盒(批号:20111208)和MDA试剂盒(批号: 20110818)均由南京建成生物工程研究所提供,水合氯醛(批号:20100709)购于国药集团化学试剂有限公司。其他试剂为国产分析纯试剂。

1.3 仪器 大鼠脑立体定位仪(美国SAI公司),脑微量进样系统(深圳瑞沃德生命科学有限公司)。

1.4 动物分组与模型的建立 取Sprague-Dawley(SD)大鼠80只,体质量180～230 g,在实验室适应性喂养1周后,行侧脑室插管手术[2]。将动物腹腔注射水合氯醛(40 mg·kg-1)麻醉后,固定于大鼠脑立体定位仪上,调节定位仪使动物头部左右对称,前后囟处于同一水平面上,沿颅顶正中剪开头皮暴露颅骨。根据Paxinos&Wastson大鼠脑图谱[3]确定侧脑室(前囟后0.8 mm,向右旁开1.5 mm,硬脑膜下4.5 mm)位置。用12号粗针在此位置上方颅骨相应部位刺一小孔(孔径约2 mm),将脑微量进样系统(外径约0.56 mm)置于脑室内。用502胶水和牙科水泥将套管固定于颅骨上,用一不锈钢管心针插入套管内,防止套管堵塞。术后大鼠单笼饲养,至少恢复7 d,恢复期间,观察记录动物的一般情况。将术后存活的大鼠70只随机分为4组(空白对照组10只,其他每组20只):①空白对照组每日腹腔注射0.9%氯化钠溶液；②MA依赖组；③z-DEVD-fmk+ MA组；④z-DEVD-fmk组[20 μg·(100g)-1]。参照文献[3]方法,MA以剂量逐日递增法按照0.5,1,2,8,10, 15和20 mg·kg-1的剂量逐日递增,bid(8∶00,20∶00),从第8天开始维持20 mg·kg-1的剂量造MA慢性依赖动物模型,腹腔注射给药。z-DEVE-fmk+MA实验组在剂量逐日递增给予MA造模的同时,每天一次脑室注射z-DEVD-fmk,剂量为20 μg·kg-1,用干预性治疗。术后每天均自由饮水,进食,并每天进行给药后1 h的行为学观察。术后开始按上述剂量逐日递增用药14 d结束后,断头处死动物,快速开颅取脑,所取脑组织按文献[4]方法冰上分离海马区,制备脑组织匀浆。

1.5 脑组织海马区NO、SOD和MDA测定 NO采用硝酸还原酶法,SOD采用亚硝酸盐显色法,MDA采用硫代巴比妥(TBA)法,采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。其中对大鼠脑中NO和MDA含量的测定,是将大鼠脑组织制成10%的匀浆；对大鼠脑中SOD活力的测定,是将脑组织制成1%的匀浆。检测方法按试剂盒操作。

2 结果

2.1 大鼠脑组织海马区NO含量的变化 MA组和z-DEVD-fmk+MA组脑组织海马区NO含量上升,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。MA组与z-DEVD-fmk+MA组比较NO含量上升较少,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 4组大鼠脑组织海马区NO含量比较Tab.1 Comparison of NO content in hippocampus of four groups of rats ±s

表1 4组大鼠脑组织海马区NO含量比较Tab.1 Comparison of NO content in hippocampus of four groups of rats ±s

与空白对照组比较,*1P＜0.01;与z-DEVD-fmk+MA组比较,*2P＜0.01Compared with blank control group,*1P＜0.01;compared with z-DEVD-fmk plus MA group,*2P＜0.01

组别大鼠/只NO/(μmol·L-1) z-DEVD-fmk+MA组105.34±0.24*1z-DEVD-fmk组104.48±0.23*1MA组106.27±0.14*1*2空白对照组104.81±0.21

2.2 大鼠脑组织海马区SOD和MDA的含量 MA组和z-DEVD-fmk+MA组脑组织海马区均有MDA含量上升、SOD活性下降,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),MA组与z-DEVD-fmk+MA组比较MDA含量上升较少,SOD含量下降较弱,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 4组大鼠脑组织海马区SOD活性和MDA含量的比较Tab.2 Comparison of SOD and MDA content in hippocampus of four groups of rats ±s

表2 4组大鼠脑组织海马区SOD活性和MDA含量的比较Tab.2 Comparison of SOD and MDA content in hippocampus of four groups of rats ±s

与空白对照组比较,*1P＜0.01;与z-DEVD-fmk+MA组比较,*2P＜0.01Compared with blank control group,*1P＜0.01;compared with z-DEVD-fmk plus MA group,*2P＜0.01

组别大鼠/只SOD/(U·mL-1) MDA/(nmol·mL-1) z-DEVD-fmk+MA组10231.58±9.01*131.64±4.05*1z-DEVD-fmk组10307.52±11.8328.43±2.70 MA组10214.61±11.37*1*237.21±4.51*1*2空白对照组10312.98±12.6328.18±3.80

3 讨论

NO是一种自由基气体,在体内有较广泛的生物学效应,具有细胞毒作用,通过多种途径引起神经细胞的直接损害,包括DNA的损伤。此外,NO可引起细胞内cGMP水平升高,GMP依赖性蛋白激酶,导致蛋白质磷酸化和去磷酸化,生成更多的NO,导致细胞功能紊乱或细胞凋亡。

当体内自由基过多时可引起机体组织细胞损伤,导致多种疾病发生和发展甚至死亡,自由基是生物体产生并损害自身的毒性产物,可引起脂质过氧化反应并产生脂质过氧化物。MDA是脂质过氧化反应的重要产物[5],其毒性作用最大,它的含量反映机体脂质过氧化的速率及强度,可间接反映组织受自由基损伤的程度。SOD是一种重要的抗氧化酶,可以清除超氧阴离子自由基,保护生物体免受自由基的攻击,对机体的氧化及抗氧化平衡起着至关重要的作用,SOD含量的高低间接反映了机体清除自由基的能力[6-7]。

本实验研究MA慢性依赖组大鼠脑组织中NO和MDA含量升高,SOD含量下降,可见MA对大鼠的脑神经细胞损伤较大,在给予Caspase-3抑制药z-DEVD-fmk干预后MA慢性依赖大鼠脑组织中NO和MDA含量升高较少,SOD含量升高明显,说明Caspase-3抑制药对MA慢性依赖组大鼠脑神经组织有一定的保护作用。Caspase基因家族在介导细胞凋亡的过程中有非常重要的作用[8],在瀑布式活化后降解其底物,使一系列细胞骨架蛋白及细胞修复酶等裂解,导致细胞凋亡。其中,Caspase-3被认为是Caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶。Caspase-3抑制药是一种多肽类特异性Caspase-3抑制药,因其具有一定的毒副作用,目前只作为实验研究用药,通过特异的抑制Caspase-3蛋白酶的活性可阻止细胞凋亡。本实验研究结果说明Caspase-3抑制药在抑制Caspase-3蛋白酶的活性阻止细胞凋亡的同时也可减少NO、MDA对脑神经细胞的损伤,并提高了SOD清除自由基的能力。但这一作用是通过哪些途径进行的还有待于进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.004

Effect of Caspase-3 Inhibitor on Content of NO,SOD and MDA in Methamphetamine-Dependent Rat Brain

LI Xin-xin1,YANG Xiu-li1,CHEN Xiao-lei1,HAO Wei2,WANG Yi-ran3
(1.Forensic Assay Office;2. Department of Functional Eχperiment Center of Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China;3.Faku Public Security Bureau,Faku 110400,China)

Objective To study the intervention and protective effect of Caspase-3 inhibitor on damaged brain tissues of methamphetamine-dependent rats.MethodsThe chronic methamphetamine-dependent rat model was established.Caspase-3 inhibitor(z-DEVD-fmk)was injected into lateral ventricles to determine the changes of NO,SOD and MDA of the hippocampus in the rats.ResultsNO and MDA were significantly increased,and SOD decreased in the hippocampus of the chronic methamphetamine-dependent rats.NO and MDA were slightly increased and SOD slightly decreased in the MA+z-DEVD-fmk plus methamphetamine-dependent rats.There was significant difference between the two groups(P＜0.01).ConclusionThe caspase-3 inhibitor can reduce the expression of NO and MDA,and increase the expression of SOD in the hippocampus of the chronic methamphetamine-dependent rats.The caspase-3 inhibitor exerts protective effect on rat brain.

Methamphetamine;Inhibitor of caspase-3;Nitric oxide;Superoxide dismutase;Malondialdehyde

R971.7;R965

A

1004-0781(2014)04-0426-03

2013-04-17

2013-10-25

*辽宁省科技攻关计划项目(2011225020)

李新新(1960-),女,辽宁沈阳人,教授,学士,研究方向:法医临床学教学、检案和科研工作。电话:(0) 18940115898,E-mail：Lixinxin9192000@yahoo.com.cn。