赵花，韦相才。，钟兴明，苗竹林＊，秦卫兵

（1．暨南大学附属第一医院，广州 510632；2．广东省计划生育科学技术研究所，广州 510600）

复发性流产是指连续发生3次或3次以上自然流产［1］，其在育龄夫妇中的发病率约1%～5%。目前仍有50%以上的患者病因不明，称为原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），临床上治疗困难。而淋巴细胞主动免疫疗法（lymphocyte immunotherapy，LIT）是目前临床上为URSA患者最常用的治疗方法之一，其治疗成功率约76%～90%［2－4］。国内外学者对其作用机制进行了大量的研究，但仍未完全明确。如何对LIT效果进行评估国内外尚无定论，目前临床上主要以封闭抗体（blocking antibody，BA）作为主动免疫疗效的监测指标，虽然具有一定的指导意义，但BA转阳的患者再次妊娠后仍可发生流产。能否探寻一些更有价值的指标来评估治疗效果、指导治疗，这也是国内外学者正积极探讨的问题之一。本文通过分析URSA患者LIT前后BA及其外周血淋巴细胞免疫表型的变化，随访其妊娠结局，探讨其可能的作用机制，并为临床疗效评价寻找新的参考指标。

资料与方法

一、研究对象

选自2012年2月至2013年8月广东省计划生育科学技术研究所生殖免疫门诊URSA患者，年龄21～38岁，经夫妇双方签字知情同意书后行主动免疫治疗。经过详细的病因筛查，排除解剖、感染、遗传、生殖内分泌及自身免疫异常，所有病例均为BA阴性者，诊断为URSA。所有入选对象半年内均未接受过激素及免疫调节治疗，治疗过程中妊娠者及未完成一疗程治疗者予以剔除，最终纳入25例。

二、研究方法

1．主动免疫治疗方法：（1）淋巴细胞来源：URSA患者丈夫需经乙肝、丙肝病毒系列检查以及肝功能、人类免疫缺陷病毒（HIV）、梅毒螺旋体、生化、血脂等筛查，正常者方可供血；异常者重新挑选健康第三方提供血源。（2）治疗方法：抽取URSA患者丈夫或健康的无关第三者空腹血30ml，与等量生理盐水混合，在无菌条件下常规分离提取淋巴细胞，用生理盐水洗涤3次后，调整淋巴细胞混悬液约0．7ml。于患者前臂内侧分3点皮内注射，每2周治疗1次，4次为1个疗程。分别于治疗前及1个疗程结束后2周，用真空肝素钠抗凝管或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集外周静脉血2ml，室温放置。检测患者淋巴细胞免疫表型，同时复查BA。

2．BA检测方法：抽取患者外周血2ml，分离血清于－20℃保存备用。用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行测定，按ELISA试剂盒（One lambda，美国）说明书进行操作。

3．实验试剂及步骤：采用FACS calibur流式细胞仪（Becton Dickinson，美国），FACS lysing solution、Tritest CD4FITC／CD8PE／CD3Per-CP鼠抗人 三 色 荧 光 抗 体、Anti-HLA-DR APC、CD16 FITC、CD56PE、CD3PerCP、CD69APC、CD25 FITC、CD127PE、CD4APC、CD5PerCP-CY5．5、CD19FITC鼠抗人荧光抗体（BD，美国）。分设试验管和对照管，各取50μl外周血，按试剂说明书加入相应抗体，混匀，室温（20～25℃）避光孵育15min。加入450μl 1×FACS lysing solution轻轻混匀，室温（20～25℃）避光孵育15min，加入2ml PBS，混匀，1 200r／min离心5min，去上清。300μl PBS重悬，流式细胞仪上机检测。

4．数据获取：使用美国CELLQuest软件，用前向角散射（forward scatter，FSC）设阈值，排除碎片干扰；在散点图SSC／FSC中圈出淋巴细胞作为分析对象，然后在散点图中分析各淋巴细胞亚群的比例。使用CELLQuest软件分析结果。

三、统计学分析

结 果

一、BA变化及妊娠结局

治疗前25例患者BA均呈阴性，LIT一疗程后21例阳性，阳性率84%。其余4例未转为阳性的患者经过继续加强治疗后均转为阳性。25例患者成功妊娠16例（已正常分娩或妊娠至孕20周后），4例再次流产。

二、治疗前后T细胞及Treg细胞表型变化

治疗后CD3＋T细胞的比例增加，CD4＋T细胞的比例明显下降，差异均有统计学意义（P＜0．05）；治疗前后表面活化标志HLA-DR在CD3＋、CD8＋T细胞中的表达并无显著性差异，但CD4＋T细胞活化的比例显著增加，差异有统计学意义（P＜0．05）。而CD4＋CD25＋CD127dimTreg细胞占CD4＋T细胞比例治疗前后并无明显变化（P＞0．05）（表1，表2）。

三、治疗前后B淋巴细胞表型变化

主动免疫治疗后外周血CD19＋B细胞的比例及CD5＋B、CD5－B细胞在淋巴细胞和B细胞中的比例均无显著变化（P＞0．05）（表3）。

四、治疗前后NK细胞表型变化

主动免疫治疗后URSA患者外周血CD3－CD56＋NK细胞占淋巴细胞的比例显著下降（P＜0．01）（表4）。

五、妊娠成功组治疗前后淋巴细胞免疫表型变化

妊娠成功组治疗前后CD3－CD56＋NK细胞、CD3＋T、CD4＋T及CD4＋HLA-DR＋T细胞比例均有显著变化，差异有统计学意义（P＜0．01）（表5）。

表1 主动免疫治疗前后外周血T淋巴细胞表型变化［（±s）%］

表1 主动免疫治疗前后外周血T淋巴细胞表型变化［（±s）%］

注：与治疗前比较，＊P＜0．05

组 别 例数 CD3＋T CD4＋T CD8＋T CD4＋／CD8＋治疗前 25 62．56±9．72 49．21±11．37 34．84±9．81 1．38±0．44治疗后 25 68．44±8．61＊ 44．35±12．63＊37．63±12．95 1．17±0．46

表2 主动免疫治疗前后外周血活化T淋巴细胞及Treg细胞变化［（±s）%］

表2 主动免疫治疗前后外周血活化T淋巴细胞及Treg细胞变化［（±s）%］

注：与治疗前比较，＊P＜0．05

组 别 例数 CD3＋HLA-DR＋／CD3＋ CD4＋HLA-DR＋／CD4＋ CD8＋HLA-DR＋／CD8＋ CD4＋CD25＋CD127dimTreg治疗前 25 25．52±9．87 12．03±5．96 30．00±12．11 6．21±1．78治疗后 25 27．32±11．55 16．33±7．01＊29．10±14．61 6．67±1．70

表3 主动免疫治疗前后B淋巴细胞表型变化［（±s）%］

表3 主动免疫治疗前后B淋巴细胞表型变化［（±s）%］

注：治疗前后比较，P均＞0．05

组 别 例数 CD19＋B CD5＋CD19＋B CD5－CD19＋B CD5＋CD19＋／B CD5－CD19＋／B治疗前 25 11．13±4．10 3．96±1．86 7．43±2．72 32．85±9．06 66．66±9．17治疗后 25 10．81±3．30 3．73±1．65 7．41±2．88 29．66±8．00 70．34±8．00

表4 主动免疫治疗前后NK细胞表型变化［（±s）%］

表4 主动免疫治疗前后NK细胞表型变化［（±s）%］

注：与治疗前比较，＊＊P＜0．01

组 别 例数 CD3－CD56＋NK CD3＋CD56＋NKT CD56dimCD16＋NK CD56bright CD16－NK CD56＋CD69＋NK治疗前 25 13．48±3．00 5．20±4．19 87．40±7．72 3．92±2．64 3．83±0．78治疗后 25 10．09±2．42＊＊5．17±4．58 89．19±6．46 3．81±1．94 3．67±0．83

表5 主动免疫治疗前后妊娠成功组淋巴细胞表型变化［（±s）%］

表5 主动免疫治疗前后妊娠成功组淋巴细胞表型变化［（±s）%］

注：与治疗前比较，＊＊P＜0．01

组 别 例数 CD3＋T CD4＋T CD4＋HLA-DR＋／CD4＋ CD3－CD56＋NK治疗前 16 50．06±8．88 50．86±10．96 10．91±5．79 15．18±2．25治疗后 16 68．47±8．59＊＊ 43．13±12．89＊＊ 16．93±5．61＊＊ 10．15±2．63＊＊

讨 论

主动免疫治疗应用于临床多年，国内外对其疗效一直存在争议［5－6］，尚无明确的疗效评价指标。本研究通过LIT前后患者外周血T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（natural killer，NK）和Treg细胞免疫表型的变化进行观察，探讨了LIT可能的作用机制，并为主动免疫疗效评价探寻了新的参考指标。

本文25例URSA患者经LIT后21例BA转阳，阳性率为84%（21／25），与国内报道［7－8］结果相似。杨宁等［9］报道BA阴性的URSA患者经同样的方法治疗1疗程后BA阳性率为78．59%（359／444），而妊娠成功率达85．58%（267／312），较传统保胎组26．67%（4／15）明显升高。这说明LIT能诱导大部分患者产生BA，明显提高妊娠成功率。近年来BA一直被认为是LIT疗效和成功妊娠的预测指标。然而临床上一些BA阳性的患者仍会发生流产，如何更加准确地进行疗效监测和病情评估，仍是国内外的研究重点，也是本研究的方向。

T淋巴细胞作为外周血中最主要的淋巴细胞，在免疫刺激、免疫调节、免疫反应中起着重要作用，因此，T细胞亚群的变化也是免疫治疗重要的观察指标之一。在正常妊娠早期，CD8＋T细胞数量增多，CD4＋／CD8＋比值的降低，有利于胚胎免遭母体免疫系统的排斥。而URSA患者外周血CD4＋T细胞比例及CD4＋／CD8＋比值明显升高，有效治疗后则可逆转［10］。国内外的研究均显示，URSA患者存在外周血T淋巴细胞亚群比例异常，而主动免疫治疗可使T淋巴细胞亚群比例和功能发生明显的有利变化。本研究发现，LIT后CD3＋T细胞比例明显增加（P＜0．05），与国外研究［11］结果一致。本研究组前期研究［12］发现，URSA患者外周血CD4＋T细胞比例较正常妇女明显升高，而本研究中妊娠成功组CD4＋T细胞比例为（43．13±12．89）%，较治疗前［（50．86±10．96）%］明显下降（P＜0．05），可见LIT能调节机体的免疫紊乱，CD4＋T细胞的降低有利于妊娠。但本研究中CD4＋／CD8＋比率并无明显变化，由于本研究选取的样本量有限，可能导致了部分结果的偏差。此外，URSA患者CD4＋HLADR＋细胞比例较治疗前显著增加。这亦提示，LIT可能主要通过抗原刺激CD4＋T细胞发挥作用，但其具体作用方式则取决于CD4＋T细胞的分化及其分泌的细胞因子，所以其对妊娠的维持是否有利尚无法定论，仍需进一步研究证实。

NK细胞有细胞毒性效应，占外周血淋巴细胞数量的10%～15%，无需抗原预先致敏就自发杀伤靶细胞，还可以通过分泌细胞因子发挥免疫调节作用。已有研究表明，NK细胞毒性和数量增加与流产有关［13］，外周血高水平的NK细胞预示染色体核型正常的妊娠可能发生生化妊娠或自然流产，并发现早孕期NK细胞活性较未孕时明显降低，表明减少NK细胞的比例和抑制其活性也许能阻止母体免疫系统对胎儿抗原的攻击，维持妊娠。本研究中16例成功妊娠患者治疗前NK细胞比例为（15．18±2．25）%，治疗后明显降低［（10．15±2．63）%］，差异有统计学意义（P＜0．01）。可见，LIT能明显降低NK细胞的比例，有利于妊娠。国外有人建议将CD3＋CD56＋NKT细胞的数量作为静脉注射用免疫球蛋白（IVIG）治疗对象的筛选指标，他们发现NKT细胞升高的患者经IVIG治疗后其数量可明显降低，并且能显著提高妊娠成功率［14］。本文对NK细胞亚群进行分析发现，治疗前后CD56dim、CD56brightNK亚群在NK细胞中的比例及NK细胞表面活化标志CD69、CD3＋CD56＋NKT细胞的比例并无明显改变，可能与样本量有关。因此，检测NK细胞免疫表型变化有助于URSA妇女病情及预后的监测，但人类NK细胞包括许多不同的亚群，很有必要对不同的亚群进行更深入研究分析。

LIT对B淋巴细胞有何影响，至今仍未完全明确。有研究表明，LIT前后CD19＋B、CD5＋CD19＋B细胞比例均无明显变化［15］，本研究结果与其一致。但他们发现URSA患者LIT后妊娠成功组CD19＋B细胞明显增加，提示CD19＋B细胞可能有利于维持妊娠。但其具体作用机制目前仍不明确，是否有利于某些保护性抗体的产生仍需进一步研究。

Treg细胞对免疫耐受具有很强的调节作用，妊娠期间Treg细胞出现系统扩增，有利于维持正常妊娠。业已证实，Treg细胞减少可能与URSA密切相关，而LIT能上调CD4＋CD25＋Treg细胞的比例。但Treg细胞缺乏特异的表面标志，有研究发现CD127的低表达与叉头蛋白3（FOXP3）的高表达及 CD4＋CD25＋Treg细胞的抑制功能相关［16］。现已证实CD4＋CD25bright细胞才是人体内真正具有调节作用的细胞，所以本文联合检测了CD25＋和CD127dim的表达，结果发现25例URSA患者和16例成功妊娠患者免疫治疗前后CD4＋CD25＋CD127dimTreg细胞的比例均无明显变化，可能与个体免疫反应低下有关，也提示LIT可能并不是通过调节Treg细胞的水平发挥疗效，但仍需增大样本进一步证实。

本研究表明，LIT后外周血淋巴细胞免疫表型发生了明显的改变，CD3－CD56＋NK 细胞和CD4＋T细胞比例的降低、CD3＋T细胞和活化的CD4＋T细胞的增加也许有利于维持妊娠，检查T细胞和NK细胞的比例变化有助于URSA妇女病情和疗效的监测，本文对LIT可能的作用机制进行了深入的探讨，也为LIT疗效监测探寻了新的指标，但仍需要增大样本量，对妊娠失败患者进行更深入的对比研究。

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