郭永，赵爱华，苏晨，3，丁宁，张瑶楠，刘庆＊，王乾兴

（1．国家人口计生委科学技术研究所内分泌室，北京 100081；2．解放军第309医院妇产科，北京 100091；3．遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，遵义 563000）

米非司酮作为一种在临床上广泛使用的口服避孕药，其分子机制仍有待于进一步深入研究。究其原因，在于作为米非司酮作用靶组织之一的人子宫内膜组织结构复杂，人子宫内膜主要由腺／腔上皮细胞、基质细胞和细胞间质等成分构成。在人子宫内膜中，包括子宫内膜细胞的生理功能、细胞间的相互作用、各种细胞对性激素的应答等正常生理过程，及子宫内膜相关疾病的发生发展的病理过程均在其中发挥作用。细胞体外培养技术已广泛应用于基础研究、临床实践和生物工程等生命科学和医学研究领域，也包括在生殖领域的运用。建立子宫内膜细胞体外培养体系是对相关分子机制进行深入分析的较理想的实验模型。但目前未有较好的人子宫内膜基质和上皮细胞系，因此，本研究拟通过组织分离原代培养的方法获得人子宫内膜基质和上皮细胞，从而建立一种简单、高效的子宫内膜细胞原代培养方法，同时分离培养高纯度的基质细胞和上皮细胞，旨在为研究子宫内膜相关生理机制提供可靠的体外细胞实验研究平台。在此基础上，我们将米非司酮直接作用于分离得到的人子宫内膜基质细胞，以研究米非司酮对月经周期中重要细胞——人子宫内膜基质细胞增殖的调控作用。

材料与方法

一、实验材料

1．人子宫内膜标本：5例，增殖期内膜组织。取自年龄40～47岁的良性妇科疾病患者，患者月经周期规律，无外科、内分泌、免疫及代谢性疾病，手术前3个月内未接受激素类药物治疗，术后均经病理确诊。

2．主 要 试 剂：米 非 司 酮 （Sigma，美 国）；DMEM／F12培养基、胎牛血清（FBS）；PBS缓冲液、0．25%胰蛋白酶（GIBCO，美国）；活性炭处理胎牛血清（Wisent，加拿大）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（Amerosco，美国）；小鼠抗人波形蛋白抗体（R＆D，美国）；小鼠抗人角蛋白抗体（Dako，美国）；DNaseⅠ（Takara，日本）；异硫氰酸荧光素（FITC）-小鼠二抗（北京中杉金桥）。

二、实验方法

1．人子宫内膜细胞原代分离培养：参照Ryan等［1］的方法加以改良，具体操作步骤如下：在无菌的环境下，将取得的人子宫内膜标本立即放入含青／链霉素的冰冷Hank’s液，洗涤3次；组织置于冰上，用眼科剪将组织剪成小于1mm×1mm×1mm大小组织块，移入三角瓶中；加入适量的0．2%胶原酶消化液，37 ℃孵育1．5h，在孵育1h时，加入15U／ml DNaseⅠ继续消化30min；消化过程中每隔20min，用涡旋器混匀一次；将消化后的细胞悬液通过50目筛网，滤去未消化的组织；再通过200目和400目筛网，滤液中以基质细胞为主，400目筛网上以腺细胞团为主。

基质细胞：滤液收集后，900r／min离心5min收获细胞，台盼兰染色计数，接种密度为2．5×105个／ml。

上皮细胞：用Hank’s液反洗400目筛网，1 100 r／min离心2min，收集细胞或细胞团；900r／min离心5min后，弃上清，加入2ml 0．05%胰酶和15U／ml DNaseⅠ，吹打10min，使细胞团分散成单细胞；获得细胞台盼兰染色，细胞计数，以5×105／ml密度接种。

基质细胞接种后1．5h，将悬浮的细胞及上皮细胞团吸出，重新加入培养液，此时基质细胞已帖壁；上皮细胞接种后2h，将悬浮的细胞及上皮细胞团吸出，转移到另一个培养瓶中。基质和上皮细胞培养液为DMEM／F12＋10%FBS（活性炭处理）。

2．人子宫内膜基质和上皮细胞波形蛋白和角蛋白的鉴定

通过流式细胞术检测方法，分别检测人子宫内膜基质和上皮细胞的波形蛋白和角蛋白表达阳性的细胞比率，鉴定分离培养的基质和上皮细胞的纯度。实验步骤如下：0．25%胰酶消化，收获细胞，细胞数不少于1×106个细胞；2%多聚甲醛固定15min；PBS洗涤2次，5min／次，1 100r／min离心收获细胞；加入1%Triton X-100，室温处理20min，PBS洗涤2次，3min／次；加入一抗工作液（小鼠抗人波形蛋白或小鼠抗人角蛋白抗体），37℃孵育1h；PBS洗涤3次，5min／次，加入荧光标记二抗工作液（FITC-小鼠二抗，1︰50），室温避光反应45min；PBS洗涤3次，5min／次，用0．5ml PBS重悬细胞，进行流式检测。以PBS代替一抗做为阴性对照。

3．MTT法检测细胞半数抑制浓度（IC50）：取对数生长期的原代分离培养的人子宫内膜基质细胞，用0．25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，分别以DMEM／F12培养基（含10%活性炭处理FBS）调整细胞悬液浓度为4×104个／ml，接种于96孔板，每孔100μl，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4h后，加入米非司酮试剂，使其终浓度分别 为 0．01、0．1、0．5、1、2．5、10、25、50 和 100 μmol／L，并设立空白组（不接种细胞）、对照组（接种细胞，但不加米非司酮）。每个浓度设置6个复孔。分别将培养板放置细胞培养箱中培养2d和3d，各孔均加入 20μl MTT 溶液 （5mg／ml，即 0．5%MTT），继续培养4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值（OD值）。取6个孔的OD值均数，按公式计算细胞抑制率（IR）＝（对照组OD值－实验组OD值）／对照组OD值×100%。以平均抑制率为Y轴，米非司酮浓度为X轴分别绘制米非司酮浓度对两种细胞抑制率的散点图。通过直线回归计算米非司酮对原代人子宫内膜基质细胞的IC50。

三、统计学方法

实验结果采用SPSS 17．0软件进行分析，流式检测结果以（±s）表示，IR值采用直线回归分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、人子宫内膜基质和上皮细胞的形态学观察

分离所得基质细胞主要为单个细胞，在1h左右迅速贴壁，刚贴壁基质细胞多呈三角形，以2．5×105／ml密度接种细胞，细胞生长迅速，4～5d即可长满培养板，细胞呈长梭形或纺锤形（图1A），相互平行排列成束。基质细胞至少可稳定传4代。

分离所得上皮细胞呈团状聚集生长，贴壁较慢，2～3h开始贴壁。刚贴壁的上皮细胞呈蝌蚪形，2d后，细胞出现漩涡状排列，团簇生长，最后生长成片。以5×105个／ml密度接种细胞，6～7d可长满培养板（图1B），生长速度较基质细胞慢。上皮细胞传代后细胞生长状态较差。

二、细胞鉴定及纯度检测结果

利用抗基质细胞特异表达的波形蛋白抗体和抗上皮细胞特异表达的角蛋白抗体，鉴定分离培养的人子宫内膜基质细胞和上皮细胞，并通过流式细胞术检测波形蛋白和角蛋白阳性细胞比率，计算分离培养的细胞纯度。以不加一抗的细胞作为阴性对照，通过参数设定，选定流式分析的细胞范围（图2）。荧光信号分析结果显示，分离培养基质细胞波形蛋白阳性率达97%，上皮细胞角蛋白阳性率达90%（表1）。说明通过该原代细胞分离方法可获得高纯度人子宫内膜基质细胞和上皮细胞。

图1 原代分离培养人子宫内膜基质和上皮细胞形态观察（200×）

三、米非司酮对原代人子宫内膜基质细胞IC50检测结果

米非司酮作用于原代人子宫内膜基质细胞2d后，随着米非司酮浓度增加，基质细胞IR值逐渐增高，其中，米非司酮浓度为50μmol／L和100μmol／L的实验组的IR值高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．05）；米非司酮作用3d后，对原代人子宫内膜基质细胞抑制作用更明显，米非司酮浓度为25、50和100μmol／L各组的IR值均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．05）。对米非司酮处理2d和3d原代人子宫内膜基质细胞抑制率进行直线回归分析，米非司酮处理2d对原代人子宫内膜基质细胞的IC50为52．85μmol／L，米非司酮处理3d对原代人子宫内膜基质细胞的IC50为86．46μmol／L（图3）。

图2 流式细胞术检测波形蛋白和角蛋白表达的荧光峰型图

表1 分离培养细胞的波形蛋白和角蛋白阳性率（%）

图3 不同浓度米非司酮对原代人子宫内膜细胞的生长抑制率比较

讨 论

目前，人子宫内膜分离方法多采用二次过滤法，即先将消化好的混悬液过200目滤网，以除去粘液和未消化组织，再过400目滤网，400目滤网上面为未消化的腺上皮细胞团，反冲滤网获得腺体细胞团，而滤液中富含基质细胞。这种方法不但无法获得高纯度的基质细胞和上皮细胞，并且腺上皮细胞团直接接种不易贴壁，存活率低，造成样本的浪费。本部分实验采用“二次酶消化－二次过滤－差时贴壁”的方法分离得到了高纯度、高产量的基质细胞和上皮细胞。具体过程是在上述方法研究基础上，将得到的上皮细胞团再用0．05%胰酶二次消化，可得到单个上皮细胞，单细胞极易贴壁，存活率高。另外，由于基质和上皮细胞贴壁时间存在差异，基质细胞在接种2h内即可完全贴壁，而上皮则是在2h后开始贴壁，因此，利用两种细胞贴壁时间不同的特性，在细胞接种后1．5～2h进行细胞换液，可有效提高基质和上皮细胞纯度。

一直以来，研究者都将波形蛋白和角蛋白作为鉴别基质细胞和上皮细胞的标识物分子。Mathews等［2］发现波形蛋白同时表达于子宫内膜基质细胞和上皮细胞。本研究结果显示，分离获得的上皮细胞中波形蛋白呈阳性，阳性率为（71．3±18．6）%。因此，本研究也证实波形蛋白不仅表达于子宫内膜基质细胞，同时还表达于上皮细胞，。因而，波形蛋白不能作为唯一鉴别基质细胞和上皮细胞的依据。目前的研究中，细胞鉴别实验多采用波形蛋白和角蛋白免疫组织化学染色，该方法步骤繁琐，可鉴别细胞数量有限，并且通过人工计数等方式计算阳性率，操作繁琐，误差大。本研究采用流式细胞术，同时检测波形蛋白和角蛋白表达情况。该方法测定的细胞数量大，细胞数量大于1×106个，同一群细胞同时检测波形蛋白和角蛋白表达，荧光信号敏感，计数精确。流式结果显示，本研究分离得到的基质细胞纯度达97%，上皮细胞纯度达90%，并且收获细胞数量多，标本利用率高。

米非司酮是1981年由法国的Roussel-Uclaf公司开发的一种人工合成的炔诺酮衍生物。经过30多年的摸索实践，米非司酮广泛地运用于临床，例如终止早孕、紧急避孕、药物流产和治疗抑郁症、脑膜瘤、阿尔兹海默综合征、库欣综合征等领域［3－5］。在米非司酮避孕机制研究中，目前文献报道呈现的结果大多为内膜组织切片的形态观察和免疫组织化学检测，干扰实验结果的因素较多，不利于分子机制探索，因此，亟待良好的子宫内膜细胞模型的建立，以为避孕分子机制的研究奠定基础。

之前关于米非司酮在子宫内膜中作用的研究提出，米非司酮抑制子宫内膜生长和分泌期改变，而更多是停留在现象的观察［6－7］，近期更多地侧重在分子水平上解释有关米非司酮作用下游相关的信号通路以及miRNA调控作用［8－11］。在本研究中，在获得高纯度的人子宫内膜基础上，采用米非司酮处理原代人子宫内膜基质细胞，观察在体外米非司酮对原代人子宫内膜基质细胞增殖的影响。结果显示米非司酮作用于原代人子宫内膜基质细胞2d和3d后，抑制原代人子宫内膜基质细胞生长，其抑制率均随着米非司酮浓度的增加而升高，存在明显的量效关系。我们在前期研究中也发现米非司酮发挥作用与其使用剂量和时间密切相关［12］。抑制率直线回归分析结果表明，米非司酮处理2d和3d后，原代人子宫内膜基质细胞的IC50分别为 52．85μmol／L 和86．46μmol／L。

综上所述，我们采用二次酶消化－二次过滤－差时贴壁的方法获得了纯度分别达97%和90%的高纯度、高产量的人子宫内膜基质细胞和上皮细胞，为后续细胞水平的研究提供了技术上的支持和保障。在此基础上，我们对米非司酮避孕分子机制进行了初步研究，结果表明米非司酮能够抑制子宫内膜基质细胞的增殖，也为深入研究子宫内膜细胞在避孕药物发挥作用的过程中扮演着的细胞角色和相关分子机制的研究奠定了基础。

［1］ Ryan IP，Schriock ED，Taylor RN．Isolation，characterization，and comparison of human endometrial and endometriosis cells in vitro［J］．J Clin Endocrinol Metab，1994，78：642-649．

［2］ Matthews CJ，Redfern CP，Hirst BH，et al．Characterization of human purified epithelial and stromal cells from endometrium and endometriosis in tissue culture［J］．Fertil Steril，1992，57：990-997．

［3］ Schaff EA．Mifepristone：ten years later［J］．Contraception，2010，81：1-7．

［4］ Sarkar NN．The potential of mifepristone（RU-486）as an emergency contraceptive drug［J］．Acta Obstet Gynecol Scand，2005，84：309-316．

［5］ Freeburg EM，Goyeneche AA，Telleria CM．Mifepristone abrogates repopulation of ovarian cancer cells in between courses of cisplatin treatment［J］．Int J Oncol，2009，34：743-755．

［6］ Prange-Kiel J，Rune GM，Wallwiener D，et al．Inhibition of proliferation and differentiation by RU486in human endometrial stromal and epithelial cells in vitro［J］．Exp Clin Endocrinol Diabetes，2000，108：275-281．

［7］ Greb RR，Kiesel L，Selbmann AK，et al．Disparate actions of mifepristone（RU486）on glands and stroma in the primate endometrium［J］．Hum Reprod，1999，14：198-206．

［8］ Hull ML，Nisenblat V．Tissue and circulating microRNA influence reproductive function in endometrial disease［J］．Reprod Biomed Online，2013，27：515-529．

［9］ Kuokkanen S，Chen B，Ojalvo L，et al．Genomic profiling of microRNAs and messenger RNAs reveals hormonal regulation in microRNA expression in human endometrium［J］．Biol Reprod，2010，82：791-801．

［10］ Ghosh D，Najwa AR，Khan MA，et al．IGF2，IGF binding protein 1，and matrix metalloproteinases 2and 9in implantation-stage endometrium following immunoneutralization of vascular endothelial growth factor in the rhesus monkey ［J］．Reproduction，2011，141：501-509．

［11］ Walter LM，Rogers PA，Girling JE．Vascular endothelial growth factor-A isoform and（co）receptor expression are differentially regulated by 17beta-oestradiol in the ovariectomised mouse uterus［J］．Reproduction，2010，140：331-341．

［12］ 郭永，何森，苏晨，等 ．米非司酮调控乳腺癌细胞增殖的研究［J］．生殖医学杂志，2014，23：306-311．