向羿全

摘 要：本次试验用人工培养的灰霉菌经过过滤、浓缩、化学试剂萃取后取得的毒素侵染拟南芥，导致植物叶片产生病变。试验表明，随温度升高，毒性增强；随稀释倍数增加，毒性降低；最适pH值为6.6。

关键词：灰霉菌；拟南芥；毒素；致病性；致病率

1.试验材料、器材：野生型拟南芥、电子、灭菌锅、超净工作台、移液枪、发酵罐、电磁炉、真空泵、分液漏斗、旋转蒸发器、无菌注射器及针头、pH仪、离心管、恒温水浴锅、摇床等。

2.试验试剂：PDA培养基、95%酒精、0.1%Hgcl、正己烷、甲醇、石油醚、三氯甲烷、0.1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L盐酸等。

3.试验方法：种植拟南芥：将野生型拟南芥种子，放入2mL的离心管（150粒左右）；离心管中加入无菌水1.5mL，浸泡30min；用95%的乙醇浸泡5min；用0.1%Hgcl浸泡5min；用无菌水浸泡5min（重复）；均匀播种于培养皿中，放入4℃冰箱保存两天；取出培养皿置于组培室；待培养皿中种子长出两片真叶后移栽至灭

菌花（4棵/盆）；盖保鲜膜，放入组培室，定期浇水，保持培养室的温度在25℃左右。

配制土豆培养基：200g土豆配制1L培养基、20g蔗糖、20g琼脂。

灰霉菌次生代谢产物的获得：在实验室的条件下，配制液体培养基，接种灰霉菌，置于摇床内培养5天左右，待观察到培养瓶内出现较大菌丝体时，接种于发酵罐内，在200转/分的速度、罐内压力保持0.5千帕下发酵培养6～7天。培养结束后，取出发酵液后，经过滤、浓缩得到次生代谢物。

化学萃取毒素：称取20g样品，加入40mL的正己烷，移入分液漏斗，用40ml甲醇水溶液分次冲洗容器，洗液并入分液漏斗；震摇2min，静置分层，将下层甲醇水溶液用40mL三氯甲烷萃取，震摇2min，静置分层；取下层三氯甲烷，经用三氯甲烷湿润过的10g无水硫酸钠和定量慢速滤纸过滤，滤液倒入蒸发皿；再用5mL三氯甲烷反复萃取，用少量三氯甲烷过滤滤液，洗液并入蒸发皿；通风挥干，收集毒素。

浓缩毒素保存：使用恒温水浴锅，在90℃下浓缩至样液原来的三分之一，置于-20℃的冰箱内保存。

毒素致病性测试：由于毒素长时间保存，在试验开始前，需对毒素的致病性进行测试。选取10片长势相近的拟南芥叶片，标记后，用无菌的一次性针头在叶片戳一小孔，用针筒侵染毒素，置于培养室内培养、观察。

4.毒素测试：不同浓度下的致病率：取灭菌后的容器，注入1mL浓缩毒素，加入无菌水，分别稀释10×、50×、100×、200×、500×、700×、1000×。按照致病性测试方法，分别侵染30片生长良好的拟南芥叶片，并用无菌水作为实验对照，培养，至病斑稳定为止，记录并计算致病率（3次重复）。

不同pH下的致病率：试验之前，先测试毒素的pH，制定pH梯度为4、5、6、7、8。取灭菌后的细口瓶，分别配制0.1mol/L浓度的盐酸和0.1mol/L浓度的氢氧化钠，再取五支灭菌后的试管加入1ml的毒素样液，加入盐酸和氢氧化钠配制成pH为4、5、6、7、8的毒素液，以毒素自身pH6为对照组。分别侵染30片生长良好的拟南芥叶片，置于培养室内观察，至病斑稳定，计算致病率。（3次重复）

不同温度下的致病率：取五支灭菌后的试管，加入1mL的毒素，分别置于40℃、60℃、80℃、100℃、120℃下处理30min后，对拟南芥进行浸染，置于培养室内观察，至病斑稳定，计算致病率。（3次重复）

在pH基础上测定毒素毒性的最适pH值：由上可知pH6-7之间存在最适pH值。取四支洁净的试管，加入等量的毒素样液，用氨水调整pH6.2、6.4、6.6、6.8，分别侵染30片拟南芥叶片，观察。（3次重复）

5.结论：随毒素浓度的降低，毒性也逐渐降低；随着pH值的增加，毒素的毒性增强，7以后随pH值的增加，毒性降低；6.6是毒素的最适pH；随着温度的升高，毒素的毒性增强。说明不同的环境条件对毒素的毒性有一定的影响。

参考文献：

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[2]郑晓莲，董金，齐秋锁，等.灰葡萄孢毒素的组分分析和生物测定.植物病理学报，1998，28（3）：269-271.

[3]周毓君，郭明申，朱宝成，等.草莓灰霉菌毒素的稳定性及致病力的研究.河北大学学报：自然科学版，1995，15（3）.

[4]祁高富，杨斌，叶建仁.植物病原真菌毒素的研究进展[J].南京林业大学学报，2000，24（02）：66-69.

（作者单位 云南省玉溪市师院附中）

编辑 马燕萍endprint