王菲菲，刘 婷，刘立明

(江南大学 食品科学与技术国家重点实验室 工业生物技术教育部重点实验室食品微生物制造工程研究室，无锡 214122)

琥珀酸作为一种重要的化工原料，广泛应用于食品、制药、农业和化工等领域。同时，还可转化为其他大宗化学品，具有巨大的潜在市场空间［1］。现在，传统的琥珀酸生产存在工艺原料短缺、耗资大和环境污染严重等问题，限制了其进一步发展。近年来，发酵法生产琥珀酸则逐渐成为国内外研究热点，主要集中在产琥珀酸放线杆菌［2］、产琥珀酸曼氏杆菌［3－4］、产琥珀酸厌氧螺菌［5］和重组大肠杆菌［6－7］等。然而，由于这些微生物存在发酵、纯化工艺复杂等原因，限制了其在工业化生产中的应用［8－10］。树干毕赤酵母(Pichia stipitis)是能利用木糖的优势菌株，而木糖广泛存在于林业及农业废弃物中，因此，研究代谢改造树干毕赤酵母生产琥珀酸对生物质资源的利用具有重要意义。此外，P.stipitis具有耐受低 pH、高糖等优点［11］，能极大地简化下游工序、降低生产成本，是发酵生产琥珀酸的潜在优势菌株。

本研究中笔者借助树干毕赤酵母全基因组代谢网络模型iTL885［12］，设计琥珀酸最佳合成途径，进而利用代谢工程策略对树干毕赤酵母进行代谢改造，以期提高琥珀酸产量。

1 材料与方法

1.1 菌种和质粒

P.stipitis FPL-UC7［13］，由美国威斯康辛大学Jeffries教授惠赠;E.coli JM109，质粒 pY26TEFGPD［14］、pUG72由笔者所在食品微生物制造工程实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器

PCR仪(Bio-Rad公司)，高效液相色谱仪(DIONEX UItimate 3000)，5 L发酵罐(上海宝兴生物设备工程有限公司)。……