徐晓臣，赵冉冉，徐 飞，李彦改，陈朝旺，檀国军

(1.邯郸市第一医院神经内科，河北 邯郸 056002；2.邯郸市第一医院急诊科，河北 邯郸 056002；3.邯郸市第一医院泌尿科，河北 邯郸 056002；4.河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050071)

·论 著·

α-硫辛酸对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠脊髓组织IL-17表达的影响

徐晓臣1，赵冉冉2，徐 飞3，李彦改1，陈朝旺2，檀国军4

(1.邯郸市第一医院神经内科，河北 邯郸 056002；2.邯郸市第一医院急诊科，河北 邯郸 056002；3.邯郸市第一医院泌尿科，河北 邯郸 056002；4.河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050071)

目的研究α-硫辛酸(Alpha-lipoic acid，ALA)对实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型中脊髓组织IL-17表达的影响。方法健康雌性Wistar大鼠50只，随机分为正常对照组(NC组)，EAE 7 d组(EAE-7 d组)、EAE 6个月病程组(EAE-6 m组)、硫辛酸急性期组(ALA-7 d组)和硫辛酸6个月病程组(ALA-6 m组)。HE染色观察病理学改变，免疫组织化学染色观察IL-17的表达变化。结果HE染色结果显示，在α-硫辛酸治疗急性期组和6个月病程组，均可减轻脊髓组织的炎性反应和髓鞘损伤。免疫细胞化学染色结果显示，EAE-7 d组大鼠IL-17蛋白的表达比正常对照组增加(P＜0.01)；EAE-6 m组大鼠IL-17蛋白的表达比正常对照组增加(P＜0.01)；α-硫辛酸处理后急性期组和6个月病程组IL-17蛋白的表达明显降低(P＜0.01)。结论α-硫辛酸在EAE大鼠模型中的保护作用可能是通过抑制IL-17的表达来实现的。

多发性硬化；α-硫辛酸；炎症；IL-17

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)和实验性自身变态反应性脑脊髓炎动物模型，都是以中枢神经系统炎性和脱髓鞘改变为病理特征的疾病，对自身髓鞘的免疫反应参与疾病发生发展的病理过程，其中。近年来研究发现α-硫辛酸(Alpha-lipoic acid，ALA)在EAE模型中具有保护作用[1]，但其发挥治疗作用的机制还不明确，国外研究发现ALA有抑制中枢神经系统T淋巴细胞和巨噬细胞增殖从而抑制自身免疫的作用[2]。本研究应用大鼠EAE模型观察ALA对脊髓组织炎症细胞浸润和IL-17表达的影响，探讨ALA对EAE保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠50只，8周龄，体重(190±10)g；清洁级豚鼠3只，体重(370±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 α-硫辛酸(Sigma公司)，卡介苗(北京生物制品研究所)，兔抗多克隆抗体IL-17(北京博奥森生物技术有限公司)。主要仪器：石蜡切片机(德国莱卡RM2015)，光学显微镜(日本OLYMPUS BX51T-PHD-J11)。

1.3 动物模型的建立 3只健康豚鼠用水合氯醛350 mg/kg麻醉，快速取脊髓，去除脊膜称重后，按照脊髓重量与冰盐水体积为1:10的比例制成豚鼠脊髓匀浆，并与等量含6 mg/ml卡介苗的完全福氏佐剂混合，在冰上抽打制备成油包水乳剂，为完全免疫抗原。分别于大鼠四肢足垫及背部皮下5个部位注射抗原匀浆(0.5 ml/只)，从而建立EAE大鼠模型。

1.4 实验分组 健康雌性Wistar大鼠随机分为五组：对照组(NC组)、EAE 7 d组(EAE-7 d组)、EAE 6个月病程组(EAE-6 m组)、α-硫辛酸急性期组(ALA-7 d组)和α-硫辛酸6个月组(ALA-6 m组)，每组各10只。ALA-7 d组和ALA-6 m组自第一次发病起给予药物腹腔注射，连续注射7 d(100 mg·kg-1·d-1)。

1.5 HE染色及免疫组织化学检查 磷酸盐缓冲液(PBS)和4%多聚甲醛灌注大鼠后，取脊髓，石蜡包埋，常规切片，行HE染色及免疫组织化学IL-17染色，置于光学显微镜下观察。对IL-17免疫组化应用Image-pro plus 6.0图像分析软件测定阳性细胞平均光密度值(Average optical density，AOD)，以AOD值代表目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析，AOD数值以均数±标准差()表示，多组间比较采用ANOVA，组间两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色 EAE-7 d组大鼠脊髓组织内可见明显单核细胞和淋巴细胞样浸润，血管周围有明显炎性浸润，神经元髓鞘稀疏，ALA-7 d组比EAE-7 d组炎性细胞浸润明显减轻，髓鞘结构好转，EAE-6m组大鼠脊髓组织可见少量炎性细胞浸润，部分髓鞘稀疏，ALA-6 m组较EAE-6 m组炎性细胞浸润明显减轻，髓鞘结构好转，见图1。

图1 大鼠脊髓病理改变（HE染色，400×）

2.2 免疫细胞化学染色结果 NC组、EAE-7 d组、ALA-7 d组、EAE-6 m组和ALA-6 m组五组大鼠脊髓阳性细胞AOD值分别为(0.23±0.01)、(0.52±0.04)、 (0.38±0.03)、(0.48±0.06)、(0.39±0.04)，IL-17蛋白的表达差异有统计学意义(F=9.13，P＜0.01)，见图2。EAE-7 d组IL-17蛋白表达比正常对照组增加118%，EAE-6 m组IL-17蛋白表达比正常对照组增加100% (t=3.85，P＜0.01)。α-硫辛酸处理后急性期组和6个月病程组IL-17蛋白的表达明显降低，表现为ALA-7 d组IL-17蛋白免疫反应强度的AOD值比EAE-7 d组降低33%(t=2.65，P＜0.01)；ALA-6 m组大鼠IL-17蛋白免疫反应强度的AOD值比EAE-6 m组降低了22%(t=3.98，P＜0.01)。

图2 各组大鼠脊髓IL-17阳性细胞AOD值

3 讨论

EAE模型很好的模拟了MS的病理过程，其神经功能评分、组织病理学、特异性T细胞增殖及其炎性细胞因子的反应等方面符合MS的发病[3-4]，广泛应用于MS的实验研究。MS的发病由多种机制参与，IL-17在MS的发生发展中发挥了非常重要的作用，IL-17/IL-23轴目前被认为是MS最重要的治疗靶点。IL-17作为前炎性细胞因子，在细胞增殖和分化、生物因子转录表达及免疫调节等生理过程中发挥了重要作用[5]。研究表明，IL-17在MS患者外周血单核细胞表达数量高于健康对照组，且表达水平增高与疾病严重程度有关联[6]，应用抑制IL-17活性的药物能够减轻EAE病情严重程度[7]。

MS可侵犯大脑、小脑、脑干、视神经及脊髓等中枢神经系统多个部位。本实验中观察到，脊髓运动神经元的病变主要表现为脱髓鞘和炎性细胞浸润，造成局部能量代谢障碍，ATP含量减少，使神经通透性增加、组织液含量增加，导致轴浆内水含量增多，最终造成轴突肿胀和髓鞘的松解，IL-17在上述病理过程中可能发挥了重要作用。

α-硫辛酸(Alpha-lipoicAcid，ALA)为维生素类药物，也是一种强抗氧化剂，主要通过清除自由基和活性氧、螯合金属离子、再生其他内源性抗氧化剂而发挥其抗氧化作用[8]，在细胞和动物模型中证实具有抗氧化应激、调节胆碱能神经[9]、神经保护[10]、保护血脑屏障[11]、改善认知[12]、调节神经酰胺含量[13]、保护线粒体[14]等作用，作为神经保护剂已被应用于多发性硬化等神经系统多种疾病的防治[15]。

本研究发现，EAE-7 d组大鼠和EAE-6 m组大鼠脊髓前角细胞有明显炎性细胞浸润，神经元髓鞘结构稀疏，EAE-7 d组大鼠的炎性浸润和髓鞘结构损伤比EAE-6 m组要严重，提示豚鼠脊髓匀浆注射成功制作大鼠EAE模型，在急性期和半年期均存在有较强的炎性浸润和神经元髓鞘结构的损坏，ALA-7 d组大鼠和ALA-6 m组大鼠的炎性浸润、神经元髓鞘结构较相应的对照组明显好转，提示α-硫辛酸对EAE短期和长期病程中存在的脊髓炎性浸润和髓鞘损伤有明显的改善作用。此外，通过免疫组织化学染色发现IL-17蛋白在EAE-7 d组大鼠和EAE-6 m组大鼠脊髓表达明显升高，α-硫辛酸治疗组IL-17的表达显著降低，提示EAE病程中在急性期和半年期均存在有较强的炎症反应，α-硫辛酸治疗后其炎症反应明显减轻。上述结果提示：α-硫辛酸可能通过抑制IL-17的表达和减轻EAE大鼠模型脊髓的炎症反应而发挥其神经保护作用。

综上所述，大鼠发病急性期及半年时脊髓运动神经元存在炎症反应、脱髓鞘损伤，α-硫辛酸处理大鼠脊髓运动神经元的炎症反应、脱髓鞘损伤明显减轻。本实验结果为进一步研究中枢神经系统脱髓鞘疾病的机制及多发性硬化的防治提供了重要的实验依据。

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Effect of alpha-lipoic acid on IL-17 expression in rats with experimental allergic encephalomyelitis.

XU Xiao-chen1,ZHAO Ran-ran2,XU Fei3,LI Yan-gai1,CHEN Chao-wang2,TAN Guo-jun4.

1.Department of Neurology, the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA;2.Department of Emergency,the First Hospital of Handan, Handan 056002,Hebei,CHINA;3.Department of Urology,the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA; 4.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050071,Hebei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of alpha-lipoic acid(ALA)on IL-17 expression in rats with experimental allergic encephalomyelitis(EAE).MethodsFifty female Wistar rats were divided randomly into five groups:the normal control group(NC group),EAE model group with 7 days(EAE-7 d group),EAE model group with 6 months(EAE-6 m group),ALA administrated EAE model group with 7 days(ALA treated EAE-7 d group), ALA administrated EAE group with 6 months(ALA treated EAE-6 m group).HE staining was used to detect the pathologic changes.Immunohistochemistry was used to detect the expression of IL-17.ResultsHE staining showed that,in alpha-lipoic acid treated groups(ALAtreated EAE-7 d group,ALAtreated EAE-6 m group),inflammatory reaction and myelin damage were all relieved.According to immunohistochemistry,the expression of IL-17 in EAE-7 d group and in EAE-6 m group was significantly increased compared to NC group(P＜0.01).However,the expression of IL-17 in alpha-lipoic acid treated groups significantly decreased compared with EAE-7 d group and EAE-6 m group respectively(P＜0.01).ConclusionAlpha-lipoic acid may exert its neuroprotective effect through ameliorating inflammative reacts.

Mutiple sclerosis;Alpha-lipoic acid;Inflammation;IL-17

R-332

A

1003—6350（2014）24—3589—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1403

2014-08-07)

河北省科技厅课题（编号：11276425）

檀国军。E-mail：ttguojun@hotmail.com