叶家宏 ，段园园，申卫红 ，黄月纯

（1.广州中医药大学，广东 广州 510405； 2.贵州省肿瘤医院，贵州 贵阳 550003；3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405)

三黄桃葛胶囊由黄芪、葛根、制大黄和地黄等中药组方，具有清热生津、益气滋阴和活血化瘀的作用，适用于治疗2型糖尿病气阴两虚夹瘀型患者。黄芪中黄酮类成分[1-2]，葛根中葛根素[3-4]，地黄中梓醇及寡糖[5-6]、大黄蒽醌[7-8]等成分，都具有不同程度的调节血糖，抑制胰岛素抵抗和糖尿病状态下异常的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的表达活性，增强胰岛素敏感性，抑制肾上腺素和四氧嘧啶所致的小鼠的血糖升高，改善糖耐量，减少胰岛素抵抗等作用。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法分别对三黄桃葛胶囊中葛根、制大黄及黄芪的主要成分进行含量测定，为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药

HP 1100型高效液相色谱仪（Agilent公司）；二极管阵列检测器（Agilent公司）；BP 211D 型电子天平（d＝0.01 mg，德国赛多利斯公司）；SK7200LHC型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；TG16-WS型台式高速离心机（湖南赛特湘仪离心机有限公司）。葛根素对照品（批号为110552-200741），毛蕊异黄酮苷对照品(批号为 110907)，大黄素对照品（批号为0756-9908），芦荟大黄素对照品(批号为110795-200806)，大黄素甲醚对照品（批号为 110758-200610），大黄酸对照品(批号为 110757-2008206)，大黄酚对照品（批号为0756-9908），均购自中国药品生物制品检定所；三黄桃葛胶囊（批号分别为20120321，20120322，20120323，自制）；甲醇为色谱纯（德国Merck公司），水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 葛根素含量测定

2.1.1 色谱条件[9]

色谱柱：Zorbax SB C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水，梯度洗脱，0～5 min甲醇为20%→25%，5～10 min甲醇为25%→30%，10～18 min甲醇为30%→30%，18～22 min甲醇为 30%→20%；检测波长：250 nm；流速：1 mL/min；柱温：室温。

2.1.2 溶液制备

取葛根素对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1 mL含 77.2 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品内容物约 0.1 g，精密称定，精密加入60%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。另取缺葛根素的阴性对照品适量，同法制成阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.1.2项下 3种溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果阴性无干扰，见图1。

线性关系考察：精密吸取葛根素对照品溶液 1，2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得葛根素回归方 程 Y＝4 322.90 X-4.57，线 性 范 围 为 0.077 ～1.54 μg(r＝0.999 9)。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液各5 μL，重复进样6次，测定葛根素峰面积。结果的 RSD为 0.13%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液 5 μL，分别于 0，2，4，8，12，24 h时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 0.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取本品（批号20120321）内容物，依法平行制备6份供试品溶液，各进样5μL。结果平均含量为 15.71 mg/g，RSD为0.23%，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的本品（批号为 20120321）内容物 6 份，每份约 0.05 g，精密称定，分别精密加入葛根素对照品溶液，依法制备供试品溶液并进样分析。结果见表1。

图1 葛根素高效液相色谱图

表1 葛根素加样回收试验结果(n＝6)

2.1.4 样品含量测定

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。

表2 7种成分含量测定结果（mg/g）

2.2 5种蒽醌含量测定

2.2.1 色谱条件[9-10]

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇 -0.1%磷酸，梯度洗脱：0～13 min甲醇为82%→82%，13～24 min甲醇为82%→90%，24～30 min甲醇为90%→82% ；检测波长：254 nm；流速：1 mL /min；柱温：室温。

2.2.2 溶液制备

精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每 1 mL含芦荟大黄素 16.4 μg、大黄 酸 20.5 μg、大 黄 素 18.1 μg、大 黄 酚 17.4 μg，大 黄 素 甲 醚23.4 μg的混合溶液，作为对照品溶液。取本品内容物约 0.5 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，加甲醇定容至5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。另取缺大黄阴性对照品适量，同供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2.2 项下 3 种溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性无干扰，见图2。

线性关系考察：精密吸取蒽醌混合对照品溶液 1，2，5，10，20，30 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归。芦荟大黄素回归方程 为 Y＝4 483.28 X-0.29，线 性 范 围 为 0.016 ～0.49 μg(r＝ 0.999 9)；大黄酸回归方程 为 Y＝ 3 196.38 X-0.95，线 性 范 围 为 0.020 ～ 0.61 μg(r＝ 0.999 9)；大黄素回归方程 为 Y＝ 3 288.48 X-1.35，线 性 范 围 为 0.018 ～ 0.54 μg(r＝ 0.999 9)；大黄酚回归方程 为 Y＝4 351.54 X-3.10，线 性 范 围 为 0.017 ～0.52 μg(r＝0.999 9)；大黄素甲醚回归方程为 Y＝ 2 056.37 X-2.47，线性范围为 0.023 ～ 0.70 μg(r＝ 0.999 9)。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液各10 μL，重复进样6次，测定峰面积。结果大黄酚、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸平均峰面积的 RSD分别为 0.29%，1.21%，0.68%，0.93% ，0.38% ，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样，测定峰面积。结果表明，大黄酚、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸平均峰面积的 RSD分别为0.15% ，0.91% ，0.45% ，0.76% ，0.33% ，表明 5 种游离蒽醌在24 h内较稳定。

重复性试验：取本品（批号为20120321）内容物，依法平行制备6份供试品溶液，各进样10 μL。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为 0.108，0.376，0.104，0.279，0.071 mg/g，RSD 均小于 1.55%，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的本品（批号为20120321）内容物 6份，每份约 0.25 g，精密称定，分别精密加入一定量的蒽醌混合对照品溶液，依法制备供试品溶液并进样分析。结果见表3。

2.2.4 样品含量测定

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算含量。结果见表2。

图2 5种游离蒽醌高效液相色谱图

2.3 毛蕊异黄酮苷含量测定

2.3.1 色谱条件[10]

色谱柱：Zorbax SB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5%甲酸溶液，梯度洗脱，0～15 min甲醇为25%→25%，15～30 min甲醇为25%→40%，30～35 min甲醇为40%→70%，35～45 min甲醇为70%→70%，45～55 min甲醇为70%→25% ；检测波长：260 nm；流速：1 mL /min；柱温：室温。

2.3.2 溶液制备

取毛蕊异黄酮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含 57.2 μg 的溶液，即得对照品溶液。取本品内容物约 0.8 g，精密称定，精密加入60%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。另取缺黄芪阴性对照品适量，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.3.2项下3种溶液各 5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性无干扰，见图3。

线性关系考察：精密吸取毛蕊异黄酮苷对照品溶液1，2，5，10，15，20，30 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得毛蕊异 黄酮苷 的 回归方程 Y＝3 755.04 X-3.92，线性范 围 为0.057 ～ 1.72 μg(r＝ 0.999 9)。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液各5 μL，重复进样6次，测定毛蕊异黄酮苷峰面积。结果的 RSD为0.23%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液 5 μL，分别于 0，2，4，8，12，24 h时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 0.34%，表明供试品溶液在24 h内较稳定。

重复性试验：取本品（批号为 20120321）内容物，依法平行制备6份供试品溶液，各进样 5 μL。结果平均含量为0.316 mg /g， RSD 为 0.26% ，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的本品（批号为20120321）内容物 6份，每份约 0.4 g，精密称定，分别精密加入一定量的毛蕊异黄酮苷对照品溶液，依法制备供试品溶液并进样分析。结果见表4。

表3 5个游离蒽醌加样回收试验结果(n＝6)

图3 毛蕊异黄酮苷高效液相色谱图

表4 毛蕊异黄酮苷加样回收试验结果(n＝6)

2.3.4 样品含量测定

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算含量。结果见表2。

3 讨论

葛根素含量测定色谱条件采用2010年版《中国药典(一部)》葛根项下方法[9]，结果葛根素色谱峰分离效果不佳，通过调整流动相比例，获得较好的分离效果。大黄游离蒽醌含量测定方法参考2010年版《中国药典(一部)》大黄项下方法[9]，参考文献[10]对流动相比例进行了优化。由于制剂中毛蕊异黄酮苷含量较低，色谱条件对毛蕊异黄酮苷色谱峰的分离效果影响较大。通过对不同色谱柱 Zorbax SB-C18，Nucleodμr C18Gravity，Kromasil 100-5 C18以及不同流动相系统乙腈-0.2%甲酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇 -0.5%甲酸的不同梯度进行筛选，确定了色谱柱为 Zorbax SB-C18柱，流动相为甲醇-0.5%甲酸梯度洗脱系统。

葛根素、大黄5种游离蒽醌、毛蕊异黄酮苷的供试品溶液制备参考《中国药典》中方法，经试验采用60%甲醇为溶剂提取葛根素、毛蕊异黄酮苷，甲醇为溶剂提取蒽醌效果较好，采用了超声处理20，30，40 min，结果超声处理30 min即提取完全。

本研究中建立的7种成分含量测定方法经方法学考察，方法准确、简便、专属性强，为三黄桃葛胶囊质量控制提供了参考。

参考文献：

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[2]李 楠，范 颖，贾旭鸣，等.黄芪及其有效部位对糖尿病模型大鼠AdipoR1、AMPK mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志，2011，26（5）：1 176-1 181.

[3]王建超，雷 婷，王 聪.葛根素在治疗糖尿病中的药理作用[J].医学综述，2009，5（20）：3 171-3 172.

[4]邓路娟，闫 铭，庞宗然，等.葛根醇提物对肥胖型2型糖尿病大血管损伤大鼠血清sVCAM-1、TNF- 的影响[J].河北中医，2008，30（9）：986-988.

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