宋 敏，王建宁，孟庆齐，包红雨，陆 化

（1.南京医科大学第二附属医院血液科，江苏 南京 210011；

2.南京医科大学第一附属医院血液科，江苏 南京 210029）

c-FLIP在恶性血液病中的表达及其临床相关性研究

宋 敏1，王建宁1，孟庆齐1，包红雨1，陆 化2

（1.南京医科大学第二附属医院血液科，江苏 南京 210011；

2.南京医科大学第一附属医院血液科，江苏 南京 210029）

目的探讨c-FLIP基因在血液肿瘤中的表达以及临床意义。方法以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测22例血液肿瘤骨髓中的c-FLIP mRNA表达，Western-Blot蛋白质印迹(WB)方法检测其c-FLIP蛋白的表达。病例包括急性白血病(AL)12例(其中初治11例及反复复发1例)、完全缓解(CR)后AL 2例、慢性粒细胞性白血病(CML)2例、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)2例、多发性骨髓瘤(MM)2例和骨髓增生异常综合征-难治性贫血伴原始细胞增多2型(MDS-RAEB-2)2例。结果初治和复发AL，初治CML、CLL、MDS-RAEB-2、MM患者c-FLIP mRNA和蛋白均表达异常增高。初治AL c-FLIP mRNA及43 kD蛋白的表达显著高于慢性白血病(CL)(P＜0.05)。MDS-RAEB-2、MM与ALc-FLIP mRNA的表达差异均无统计学差异(P＞0.05)，但MDS 55 KD、43 KD蛋白表达明显低于AL(P＜0.05)，而MM无明显差异。对照组mRNA及其蛋白均阴性表达，CR后AL mRNA阴性表达，但其蛋白均有表达，低表达于AL，尤其43 kD明显低于AL(P＜0.05)。c-FLIP表达在初治AL患者与其年龄、性别、初诊白细胞数、LDH以及核型、免疫表型无关。AL患者c-FLIP mRNA及其蛋白表达与初治疗效无明显相关性(P＞0.05)。结论血液肿瘤患者c-FLIP mRNA及其蛋白表达异常增高，能够反映出恶性血液病患者骨髓造血细胞的凋亡抑制情况，与恶性血液病的类型、疾病的状态以及病程中的临床疗效、预后等都密切相关。

c-FLIP；恶性血液病；RT-PCR；Western blot

恶性血液病是一类难治性血液系统肿瘤，治疗棘手，生存期短，预后差，具体发病机制至今尚未明了。凋亡异常是恶性血液病发病和耐药的重要机制之一。对白血病及其他肿瘤细胞凋亡机制的研究和探索有利于帮助该类患者改善临床缓解率、克服耐药及改善预后[1]。细胞型Fas相关死亡区域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)为新发现的直接作用于Caspase介导的凋亡途径终极部位的凋亡抑制蛋白，它含有两个连续的N端死亡效应域(DED)，其后包含一个由C端延伸的Caspase结构类似区域，但无蛋白水解酶的活性，而可以竞争的结合于含死亡结构域(DD)Fas相关蛋白(FADD)或者Caspase-8的DED，进一步的阻断了死亡诱导信号复合体(DISC)形成；强效的抑制死亡受体(DR)——Fas、TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)-R、TNFR1(肿瘤坏死因子的受体)诱导下的细胞调亡。

本研究使用RT-PCR检测22例血液恶性肿瘤患者骨髓单个核细胞的c-FLIP的mRNA表达，以及采用Western-Blot方法检测其c-FLIP蛋白表达水平，同时分析了c-FLIP mRNA与蛋白表达的相关性，及不同分子量的c-FLIP蛋白在不同患者中的表达情况。对恶性血液病患者体内细胞凋亡的激活状态进行了初步的探索，并探讨了c-FLIP基因与血液恶性肿瘤的不同类型、疾病的不同状态和临床疗效及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 急性白血病(AL)12例，其中初治急性非淋巴细胞白血病(ANLL)7例(1例M1，2例M2，2例M3，2例M5)，初治急性淋巴细胞白血病(ALL)3例(1例伴ph+，1例伴髓系表达)，1例初治急性混合细胞白血病，1例反复复发M1，2例完全缓解(CR)后M2，2例初治慢性粒细胞性白血病(CML)，2例初治慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，多发性骨髓瘤(MM)初治患者2例，骨髓增生异常综合征-难治性贫血伴原始细胞增多2型(MDS-RAEB-2)初治患者2例。骨髓标本来自于2006年10月至12月的住院和门诊患者，其中男性15例，女性7例，年龄16～71岁(平均47岁)。同时采用2例同期轻度白细胞数减少，骨髓象正常的患者作为正常对照组。以张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》作为急性白血病的诊断标准参照及白血病完全缓解标准参照。

1.2 方法

1.2.1 骨髓标本的采集方法和单个核细胞(MNC)分离 以无菌操作抽取22例恶性血液病患者和2例对照者的抗凝骨髓4 ml，加入等量PBS稀释后以淋巴细胞分离液分离出骨髓的MNC，PBS洗涤两次后在光学显微镜下计数，调整MNC的浓度至3×106个，采用常规冻存的方法将标本放于-70℃冻存以备用。

1.2.2 RT-PCR 将冻存细胞复苏以后，以PBS液洗涤3次，以Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)提取细胞中的总RNA，生物分光光度计(德国，Eppendorf公司)测定其D260/D280值均在1.8～2.0，在琼脂糖变性凝胶电泳上见28S和18S条带，证明细胞标本中的RNA无降解。以25 μl的反应体系(美国，Promega公司)，其中包含有2 μg总RNA，2 μl的Oligo(dT) (0.5 μg/μl)，5 μl的5×RT Buffer，2.5 μl的dNTP mix，3 μl的AMV Reverse Transcriptase，1 μl的Rnasin Ribomuclease Inhibitor(10 U/μl)。在42℃水浴中1 h，在95℃时终止其反应5 min，所得的cDNA在-20℃保存以备用。在50 μl的反应体系里包含2 μl的cDNA，5 μl的10×Buffer，1 μl(0.2 mmol/L)的dNTP mix，一对各1.25 μl引物，0.5 μl的Tag酶(5U/μl)，3 μl的MgCl2(1.5 mmol/L)；在95℃时预变性5 min、94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，共35个循环。在72℃延伸5 min。取其扩增产物5 μl在1.2%琼脂糖凝胶上电泳30 min(电压为110 V，0.5×TBE为缓冲液)。以凝胶成像分析系统(美国，Cold Spring)进行信号的扫描，用Quantity One4.5.2软件(美国，Bio Rad)定量分析。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参。半定量分析扩增条带以目的条带/内参辉度值作为实验结果的观测指标。

1.2.3 Western Blot蛋白质印迹 采集好的细胞标本在复苏后用PBS洗涤3次，按照蛋白抽提试剂盒所提供操作步骤来提取出标本的总蛋白并测定蛋白的浓度。蛋白上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用电转仪(美国，Bio Rad公司)，把蛋白转移到PVDF膜(美国，Bio Rad公司)上，在转膜结束后用脱脂奶粉溶液封闭过夜，与兔抗FLIP多抗(R&D公司)在室温下孵育1 h，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育1 h，最后用ECL化学发光(PIERCE公司)，X光片曝光后显影、定影。通过成像软件Quantity One 4.5.2，与Beta.actin对比后进行半定量分析。

1.3 统计学方法 所有实验数据采用统计软件SPSS 17.0处理。计量数据以均数±标准差()表示，两样本均数比较使用成组设计t检验，两两比较方法采用Scheffe法。相关性分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-FLIP基因的mRNA和c-FLIP基因的蛋白在血液肿瘤患者中的表达 血液肿瘤患者骨髓的单个核细胞中c-FLIP基因的mRNA及其蛋白均检测出表达的异常增高。Western印迹检测结果显示所有恶性血液病患者骨髓核细胞中，均呈现c-FLIP蛋白表达(图1)，所有患者均表达c-FLIPL(55 kD)、p43-FLIPL(43 kD)、c-FLIPS(26 kD)、p33-FLIPL(33 kD)、p22-FLIPL(22 kD)等。

图1 恶性血液病患者cFLIP基因的蛋白表达

2例正常对照者mRNA及其蛋白均阴性表达。2例治疗完全缓解后AL患者mRNA的表达为阴性，但其c-FLIP蛋白均有表达，但低于12例(初治+复发)AL的c-FLIP表达，同时两者之间的43 kD表达差异有统计学意义(P＜0.05)。白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表达见表1。初治ANLL和初治ALL的c-FLIP mRNA表达差异无统计学意义，但55 kD的表达ALL显著高于ANLL，43 kD蛋白表达无明显差异。其中1例急性混合细胞白血病：55 kD：0.49；43 kD，0.62；mRNA，0.89。1例反复复发并且多种化疗药物耐药的M1患者c-FLIP基因的mRNA表达(0.99)明显增高，蛋白表达亦明显增高，55 kD：2.0；43 kD：1.9。AL c-FLIP mRNA及其43 kD蛋白的表达显著高于慢性白血病(CL)，55 kD蛋白的表达亦高于CL，但差异无统计学意义(P＞0.05)。其中2例CML蛋白55 kD表达(0.50±0.00)、43 kD(0.50±0.01，P=2)均低表达于12例AL，但差异无统计学意义(P＞0.05)；但CMLmRNA表达(0.43±0.01)，显著低于AL的表达(P＜0.05)。2例CLL蛋白55 kD表达(0.90±0.14)、43 kD表达(0.48±0.11，n=2)、mRNA表达(0.80±0.04)均低表达于AL，尤其43 kD蛋白的表达，但差异均无统计学意义(P＞0.05)；2例CLL的55 kD蛋白(0.90±0.14)的表达亦高于2例CML(0.50±0.00)。2例MM蛋白55 kD表达(0.45±0.07)、43 kD(0.45±0.07，n=2)、mRNA表达(0.73±0.15)均低表达于AL，尤其是蛋白的表达，但由于病例少，差异均无统计学意义(P＞0.05)。2例MDS者55 kD表达(0.20±0.00)、43 kD(0.20±0.00，n=2)均明显低于AL的表达(P＜0.05)，而其mRNA表达(0.83±0.04)，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表达()

表1 白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表达()

55 kD检验值P值43 kD检验值P值mRNA检验值P值0.81±0.25 -2.76 0.025 0.91±0.18 0.53 0.61 0.89±0.30 -0.54 0.61 1.38±0.41 -2.76 0.025 0.84±0.23 0.53 0.61 0.99±0.23 -0.54 0.61 1.03±0.49 1.54 0.15 0.95±0.35 3.03 0.01 0.92±0.25 5.05 0.00 0.48±0.35 1.54 0.15 0.18±0.04 3.03 0.01 0.00 5.05 0.00 1.03±0.49 1.56 0.14 0.95±0.35 3.17 0.01 0.92±0.25 2.62 0.018 0.69±0.23 1.56 0.14 0.49±0.05 3.17 0.01 0.61±0.20 2.62 0.018

2.2 c-FLIP基因的表达与急性白血病患者临床特征的相关性 分析c-FLIP基因mRNA及c-FLIP基因蛋白的表达与初治急性白血病患者的年龄、性别、初诊时的白细胞计数、LDH及核型的相关性，发现其差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。但其中多种染色体异常的患者[除去仅有t(15；17)者]55 kD蛋白表达高于正常染色体者(P＜0.05)，病例数尚需累积。

2.3 c-FLIP基因的表达与初发急性白血病的免疫表型的关系 用流式细胞术来检测白血病细胞的CD13、CD33、CD34、HLA-DR的表达。实验结果显示CD13、CD33阳性组55 kD、45 kD、mRNA表达分别为(0.92±0.56)、(0.77±0.22)、(0.77±0.22)(n=9)；CD13、CD33阴性组分别为(0.88±0.34)、(0.78±0.37)、(0.88±0.37，n=2)，表达差异无统计学意义(P＞0.05)。CD34、HLA-DR阳性组55 kD、45 kD、mRNA表达分别为(0.93±0.26)、(0.78±0.43)、(0.94±0.33，n=8)；阴性组分别为[(0.89±0.38)、(0.77±0.27)、(0.76±0.32)，n=3]，表达差异无统计学意义(P＞0.05)。CD13阳性的表达组和CD33阳性的表达组其差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 c-FLIP基因的表达与急性白血病的首次治疗疗效的关系 2例初治的M3患者均完全缓解(CR)，其余9例初治AL中1例治疗相关性死亡，1例ALL(伴髓系表达)没有治疗，其总的CR率为66.67% (6/9)。初发的AL首次化疗以后未能达到CR(NR)者c-FLIP基因的mRNA表达[(0.91±0.03)，n=3]高于达到CR的患者[(0.67±0.21)，n=4]，但其差异无统计学意义(P=0.23)，与我们既往研究一致。55 kD蛋白表达差异无统计学意义，NR者[(0.92±0.61)，n=3]；CR者[(0.83±0.28)，n=4]；43 KD蛋白表达差异无统计学意义，NR者[(0.56±0.08)，n=3]；CR者[(0.70±0.26)，n=4]。1例急性混合细胞白血病为治疗相关死亡mRNA表达0.89，但蛋白表达55 kD：0.49；45 kD：0.62，却无明显的蛋白表达增高。1例急性淋巴细胞白血病伴ph+者mRNA表达0.93，但蛋白表达55 kD：1.35；45 kD：0.58，55 kD表达亦明显增高，患者临床治疗未达缓解，最终死亡。1例反复复发并且多种化疗药物耐药M1患者c-FLIP基因的mRNA表达(0.99)明显升高，蛋白表达亦明显增高，55 kD：2；45 kD：1.9，且反复治疗未能达CR，最终死亡。

表2 c-FLIP基因表达与初治急性白血病临床特征的关系()

表2 c-FLIP基因表达与初治急性白血病临床特征的关系()

年龄(岁)≥18＜18检验值P值性别1.04±0.54 0.99±0.00 0.11 0.91 0.95±0.39 0.95±0.00 0.01 0.99 0.93±0.27 0.88±0.11 0.28 0.78男女检验值P值白细胞数(×109/L)≥50＜50检验值P值乳酸脱氢酶(U/L)≥600＜600检验值P值核型正常其他[除外t(15;17)]检验值P值9 2 5 6 3 8 5 6 4 5 1.16±0.54 0.85±0.40 1.08 0.31 1.04±0.42 0.83±0.21 1.03 0.33 0.90±0.28 0.95±0.23 -0.31 0.76 0.92±0.48 0.94±0.43 -0.08 0.94 0.67±0.29 0.86±0.20 -1.16 0.28 1.02±0.29 0.89±0.28 0.68 0.52 0.84±0.25 1.03±0.56 -0.69 0.51 0.87±0.24 0.73±0.22 0.96 0.36 0.97±0.28 0.90±0.30 0.42 0.69 0.60±0.27 1.03±0.21 -2.56 0.043 0.76±0.22 0.88±0.20 -0.80 0.45 0.87±0.38 0.95±0.19 -0.37 0.72

2.5 c-FLIP mRNA、55 kD、43 kD蛋白表达相关性分析 分析12例AL患者c-FLIP mRNA、55 kD、43 kD蛋白表达相关性分析：c-FLIP 55 kD蛋白的表达与其mRNA表达无明显相关性(r=0.249，P=0.435，P＞0.05)；c-FLIP 43 kD蛋白的表达与其mRNA表达无明显相关性(r=0.296，P=0.351，P＞0.05)；但c-FLIP 55 kD蛋白和43 kD蛋白表达存在相关性(r=0.655，P=0.021，P＜0.05)。其中ANLL、ALL患者的c-FLIP 55 kD、43 kD蛋白表达与其mRNA亦无明显相关性(P＞0.05)。

3 讨论

c-FLIP是一种新近发现的直接作用于Caspase环节的凋亡抑制蛋白，由Irmler等[2]1997年首先在研究恶性黑色素瘤时发现。c-FLIP基因定位在人类染色体的2q33，它的mRNA的表达形式有多种的拼接亚型，但目前研究显示其在体内表达的蛋白形式仅有FLIPL、FLIPS、FLIPR三种亚型。FLIPL的相对分子质量为55 kD，FLIPS为26 kD。研究表明，这两种亚型均能显著的抑制FAS介导的细胞凋亡[3]。FLIPR是新发现的分子量更小的而其功能类似于FLIPS的表达蛋白[4]。在Fas介导的死亡信号转导通路中，随着Fas的刺激，DISC的形成，proCaspase-8与DISC的结合后，首先裂解产生p43/p41和p12两个亚单位；然后列解成为活性酶亚单位p18和p10，并产生p26/p24原结构域。最后以形成的活性的Caspase-8异四倍体(p102-p182)形式释放入细胞浆而传导细胞的凋亡信号。活性Caspase-8直接导致下游的效应分子proCaspase-3, 7,9的活化，并裂解下游效应Caspases[5]。c-FLIP因其结构与Caspase-8/10的相似性，而竞争性的强效的抑制了Caspase介导的凋亡。

FLIP除了通过与DISC的绑定而发挥其抑制凋亡外，Thome等[6]研究中发现，在NF-κB信号转导途径中，高浓度c-FLIPL亦能激活NF-κB[7]。Kataoka等[8]研究揭示，由c-FLIPL介导的NF-κB活化需要p43-FLIP片断的参与。2006年，Golks等[9]研究发现了新的FLIP片段：p22-FLIP。研究发现，在恶性肿瘤细胞、成熟树突状细胞(DCs)、原始T、B淋巴细胞中，p22-FLIP为激活NF-κB关键的中介物，它通过IKKγ亚基与IKK复合物直接绑定，强烈的诱导了NF-κB的激活。该研究揭示了c-FLIP介导的激活NF-κB在淋巴细胞中生存/死亡决策的新机制。研究发现p43-FLIP和c-FLIPL需要进一步裂解为p22-FLIP以诱导NF-κB活化，提出p22-FLIP是c-FLIP诱导NF-κB活化的最终产物。而体外实验显示，活化的成熟的Caspase-8异四聚体p102-p182裂解c-FLIPL产生p12-FLIP和p43-FLIP，而不是p22-FLIP。

文献显示c-FLIPL在其发挥生存/死亡决策的新机制的作用过程中，进一步被裂解为p43-FLIP、p12-FLIP以及p22-FLIP等活性裂解产物和COOH-末端的p33-FLIP等片段，在凋亡、信号转导途径中发挥了其凋亡抑制和调节的基本功能。我们本次研究显示：在恶性血液病患者的骨髓单个核细胞裂解液中存在c-FLIPS(26 kD)、c-FLIPL(55 kD)、p43-FLIP(43 kD)、p33-FLIP(33 kD)、p22-FLIP(22 kD)等c-FLIP裂解产物，提示在恶性血液病患者体内存在着c-FLIP抑制FAS等死亡受体诱导的凋亡，激活NF-κB等抗凋亡途径而发挥了其在生存/死亡决策新机制中重要的决定和调节的作用。因此，我们希望通过进一步探讨恶性血液病患者的c-FLIP表达与临床特征、治疗、预后相关性的分析，为人们在探索治愈恶性血液病的治疗学中提供一个新途径。

恶性血液病因其发病机制不同，造血细胞的增殖、分化、凋亡的状况亦有所不同，而决定了其为一大类具有不同临床表型、临床特征及病程、不同的治疗效果、不同预后的血液系统肿瘤。本次研究采用Western-Blot方法检测恶性血液病患者c-FLIP基因蛋白表达的结果分析显示：AL均呈现高表达，AL 43片段表达高于55 kD，只有髓系43 kD片段表达高些，ALL均略弱于AML。2例M3表达小于其他类型者，可能与细胞的成熟度有关。1例混合型AL均强表达，1例反复复发M1患者均极强表达，高于其他，43 kD表达极强。1例M2 CR仍有55 kD表达，但43 kD以下表达非常弱。2例CLL 55 kD明显强表达，甚至相近AL，但43 kD以下低表达弱55 kD，且小于AL。CML均低表达，明显弱于CLL、AL。2例MM均表达，甚则43 kD大于55 kD，显示其仍与疾病的恶性度有关。2例MDS患者均弱表达，43 kD大于55 kD，显示其仍与疾病的预后、发展有关。CLL虽然是形态上类似成熟淋巴的慢性白血病，但测定中显示2例CLL 55 kD明显强表达，甚至相近于AL，但43 kD以下低表达弱于55 kD，且小于AL。所有实验结果我们仍希望增大病例数检测数据来更好的进行统计分析，有助于帮助评判各片段在恶性血液病中表达的临床和发病机制的研究。对于其在临床诊疗、预后判断、治疗选择等方面存在的某种关联性亦尚需积累病例数进一步揭晓。

本次研究的结果提示：正常对照组c-FLIP基因的mRNA和蛋白表达均为阴性。已达CR的AL患者c-FLIP基因的mRNA表达也为阴性，但仍有c-FLIP蛋白表达，明显低表达于初治AL，尤其是AL已达CR的患者的43 kD蛋白的表达与初治AL比较差异有显著统计学意义(P=0.01，P＜0.05)。在血液恶性肿瘤患者中，c-FLIP mRNA、蛋白的表达均异常增高，所有初发、复发AL患者c-FLIP基因的蛋白均表达增高，复发患者的c-FLIP基因的蛋白表达也明显升高，并且预后差，且对多种的化疗药物耐药，疗效差。其中1例多次更换化疗方案疾病仍不能好转，仍呈现高白，其原始细胞高达98%而最终死于出血和感染。本次研究未发现ANLL中c-FLIP基因的蛋白表达与患者的FAB分型或者患者的免疫表型有着密切的联系(P＞0.05)，在一定程度上提示c-FLIP基因的蛋白表达可能与急性非淋巴细胞白血病细胞所处的分化阶段并无明显的关系，但尚需积累更多的病例资料以进一步探索。尽管临床上患者的首次治疗后未能达CR的初发AL患者c-FLIP基因的mRNA表达高表达于可达到CR患者，但其差异无统计学意义(P＞0.05)，本次研究未显现c-FLIP蛋白的表达与临床首次治疗的缓解率有关(P＞0.05)。本研究分析AL患者c-FLIP 55 kD蛋白的表达与其mRNA表达无明显相关性(r= 0.249，P=0.435，P＞0.05)；c-FLIP 43 kD蛋白的表达与其mRNA表达无明显相关性(r=0.296，P=0.351，P＞0.05)；但c-FLIP 55 kD蛋白和43 kD蛋白表达存在相关性(r=0.655，P=0.021，P＜0.05)。但尚需积累更多病例资料统计，以助进一步分析、揭示c-FLIP基因在恶性血液病患者体内转录、翻译、蛋白表达的基本途径，以期作用于临床。

既往研究[10]显示CLL患者c-FLIP mRNA表达明显高于CML患者，因其疾病的状态、疾病的恶性程度不同而低表达于AL。本次研究发现：CLL的c-FLIP蛋白的表达亦明显增高，并明显高于CML，而低于AL(P＞0.05)，尚需累积病例数。既往研究[10]提示初发慢性期CML患者的c-FLIP mRNA表达显著低于初治AL，本次研究发现，其c-FLIP蛋白表达高于正常对照组，亦低于初发AL患者，但因病例数偏少，差异无统计学意义。我们初步可以得出c-FLIP基因的蛋白表达与恶性血液病的类型、疾病当时所处的状态和其不同的恶性程度有密切关系。有研究显示MDS随着病情的进展，原始细胞的增多，出现了对Fas诱导的凋亡发生了抵抗的原始细胞组群。本研究中的2例MDS-RAEB-2患者的c-FLIP基因的mRNA表达明显升高，与AL的cFLIP基因的mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。但终因其恶性度低于AL患者，其c-FLIP蛋白表达明显低于AL患者(55 kD，P=0.04，P＜0.05；43 kD，P=0.01，P＜0.05)，显示c-FLIP的表达与疾病的进程和预后密切相关。2例MM患者c-FLIP基因mRNA和c-FLIP基因的蛋白表达升高，但与AL差异无统计学意义(P＞0.05)，这也提示其有助于对疾病的状态及预后的判断。因本文收集病例数偏少，尚需积累更多的临床资料。

我们的研究显示：c-FLIP基因是一种重要的恶性血液病相关的凋亡抑制蛋白。c-FLIP基因的表达水平与评价恶性血液病的疾病状态、临床疗效、预后有着密切的相关性。检测血液系统恶性肿瘤患者体内的c-FLIP基因的表达可以作为评估其病情的发展和判断其预后的重要指标。进一步的阐明血液系统恶性肿瘤患者的c-FLIP基因的作用机制也将有助于其基因治疗的研究。而恶性血液病骨髓单个核细胞中c-FLIP的不同分子量蛋白的表达在疾病发病机制中所起的作用的真正途径尚需进一步积累病例研究。

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Expression and clinical significance of c-FLIP in hematologic malignancies.

SONG Min1,WANG Jian-ning1, MENG Qing-qi1,BAO Hong-yu1,LU Hua2.1.Department of Hematology,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011,Jiangsu,CHINA;2.Department of Hematology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore c-FLIP(cellular FLICE inhibitory protein)expression and its clinical significance in hematologic malignancies.MethodsExpression level of c-FLIP mRNA and protein in bone marrow mononuclear cells was determined by Semi-Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(Semi-RT-PCR)and Western blot in 22 patients of hematologic malignancies,which included 11 cases with newly diagnosed acute leukemia(AL),1 case of relapsed AL,2 cases of AL after complete remission(CR),2 cases of chronic myelocytic leukemia (CML),2 cases of chronic lymphocytic leukemia(CLL),2 cases of multiple myeloma(MM)and 2 cases of mycelodysplastic syndrome-refractory anemia with excess blasts-2(MDS-RAEB-2).ResultsExpression level of c-FLIP mRNA and protein were higher in patients with newly diagnosed or relapsed AL and newly diagnosed CML,CLL, MDS-RAEB-2,MM.Levels of c-FLIP mRNAand protein of 43 kD were higher inAL than in newly diagnosed chronic leukemia(CL),P＜0.05.There were no significant differences in mRNA between MDS-RAEB-2,MM and AL(P＞0.05).The levels of c-FLIP protein of 55 kD and 43 kD were lower in MDS than those in newly diagnosed AL(P＜0.05).The expression of normal subjects in mRNA and protein were negative.The expression of AL after CR was negative in mRNA,but positive in protein,and lower than AL,especially in protein of 43 kD(P＜0.05).The expression level of c-FLIP was not associated with age,sex,WBC,LDH,cytogenetic characteristics,immunophenotype(P＞0.05).There were no significant differences in that of curative effect(P＞0.05).Conclusionc-FLIP was highly expressed in hematologic malignancies.The level of expression reflected apoptosis of hematologic malignancies,and was closely related with the type and situation of hematologic malig-nancies,chemotherapeutic effects and prognosis.

c-FLIP;Hematologic malignancies;RT-PCR;Western blot

R552

A

1003—6350（2014）23—3439—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1347

2014-06-17)

南京医科大学科技发展基金重点项目（编号：2010NJMUZ49）

宋 敏。E-mail：songmin218@163.com