秦贞苗，李海龙，谭银丰，赖伟勇，蔡红蝶，张小坡，陈 峰

（1.海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571101；2.海南医学院药学院，海南 海口 571101）

·论 著·

大鼠灌胃缩泉方制剂后尿、粪中的益智活性成分及代谢物的测定

秦贞苗1，2，李海龙1，2，谭银丰1，2，赖伟勇1，2，蔡红蝶2，张小坡1，2，陈 峰1，2

（1.海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571101；2.海南医学院药学院，海南 海口 571101）

目的研究大鼠灌胃缩泉胶囊和缩泉丸后，诺卡酮、益智黄酮(杨芽黄素、伊砂黄素、白杨素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚)和益智中二芳基庚烷类成分(益智酮甲、益智酮乙、益智醇)在尿和粪中的物质形式。方法雄性Sprague Dawley经灌胃给予缩泉胶囊(3.54 g/kg)和缩泉丸(3.77 g/kg)后置于代谢鼠笼中，收集12 h的尿液和粪球。粪球称重后加入9倍体积的去离子水，高速匀浆。分别取100 μl尿液和粪球匀浆液于离心管中，加入300 μl甲醇，漩涡振摇5 min，13 000次/min下离心10 min，取上清液，在N2下吹干，残渣用50 μl甲醇复溶，再次振摇和离心，取上清液40 μl，利用液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)进行分析。结果根据上述对照品在生物样品中的LC-MS/MS出峰情况，通过比较空白尿、粪样品与给药后相应的尿粪样品，研究发现，大鼠灌胃后，在尿液和粪便中主要检测到原形物质形式，未检测到葡萄糖醛酸结合物等二相代谢产物。结论大鼠尿液中检测到的诺卡酮、益智酮甲以及杨芽黄素等成分，可能是直接作用于膀胱而发挥调节膀胱功能的活性成分。

缩泉丸；缩泉胶囊；排泄；液相色谱-质谱联用仪

尿失禁是常见慢性疾病之一，严重影响患者的生活质量。西药在临床使用中占主导地位，缩泉丸是为数不多的中药品种之一。本课题组在分析缩泉丸物质组成[1]的基础上先后分析了大鼠灌胃缩泉丸后主要成分在血浆[2-3]以及胆汁[4]中的暴露形式。本文主要探讨大鼠灌胃缩泉丸和胶囊后大鼠尿、粪中黄酮类和二芳基庚烷类物质的暴露形式。

1 材料与方法

1.1 试药 杨芽黄素、伊砂黄素、白杨素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚标准品由本课题组从益智中分离制备[5]。益智酮甲、益智酮乙和益智醇购自凯方医药科技(上海)有限公司，以上化合物的纯度均在98%以上。色谱纯级甲醇和乙腈购自美国Tedia公司；色谱级纯水由去离子水通过Milipore纯水系统制备。其他化学试剂(分析级或以上级别)购自海南诣高仪器有限公司。缩泉胶囊购自湖南汉森药业有限公司(批号110602)，缩泉丸购自广东华天宝药业集团有限公司(批号1110103)。

1.2 实验动物 雌性Sprague Dawley大鼠，体重200～230 g，购自湖南省长沙市开福区东创实验动物科技服务部。大鼠自由进食和饮水，给药前夜禁食不禁水。

1.3 供试样品的制备 取缩泉胶囊去除胶囊壳，将内容物合并混合均匀，称取适量置玻璃研钵中，用0.5%羧甲基纤维素钠分散均匀后加水适量，制成0.24 g/ml的供试品。缩泉丸研磨粉碎后，同法制备，得到0.25 g/ml的供试品溶液。

1.4 给药和尿粪样品收集 动物实验前1 d进行抓拿适应性实验，置于代谢鼠笼中适应1 d，收集空白尿、粪样品。大鼠分为两组，经灌胃分别给予大鼠缩泉丸(3.77 g/kg)和缩泉胶囊(3.54 g/kg)。给药后收集12 h内尿粪样品，粪球称重，样品置于-70℃备用。

1.5 仪器 美国AB公司的AB-SCIEX API 4000 plus串联四级杆质谱仪，通过Turbo V离子源接口与岛津公司Prominence UFLC液相色谱仪串联。液相色谱仪配制LC-20AD双泵系统，DGU-20A3R在线脱气机，SIL-20AHT自动进样器和CTO-20A柱温箱。AB-SCIEX软件控制数据采集和处理。

1.6 尿、粪样品的处理 粪球样品加入9倍体积的去离子水，高速匀浆，制备匀浆液。分别取100 μl尿液和粪球匀浆液样品，加入300 μl甲醇，振摇后放在漩涡振荡器上震荡10 min，结束后将样品至于离心机中，于13 000次/min下离心10 min，吸取上清液390 μl，在N2下吹干，加入50 μl甲醇，在漩涡振荡器上震荡5 min，再同法离心，吸取40 μl样品溶液置于样品瓶的内衬管中，供分析用，进样量10 μl。

1.7 LC-MS/MS分析方法 分析方法请参考本课题组发表的文献[4]。简单的说，采用Phenomenex Kinetex 2.6 μ XB-C18色谱柱(2.10 mm i.d×50 mm)进行样品的分离分析，温度控制在40℃。以甲醇-水为流动相(含0.1‰甲酸)，梯度洗脱，正离子模式下多反应检测扫描(MRM)检测。

2 结果

2.1 尿、粪样品中诺卡酮的测定 大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿(保留时间tR为7.30 min)、粪样(tR为7.26 min)品中均可检测到诺卡酮的原形物质形式(图1)。

图1 大鼠尿、粪样品中诺卡酮的MRM图谱

2.2 二芳基庚烷类成分及其代谢物的测定 大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿、粪中二芳基庚烷类成分的测定见图2～图4，未检测到益智二芳基庚烷类成分的二相结合代谢产物。由图2可知，在大鼠的尿样品中可检测到益智酮甲(tR为6.98 min)的原形物质形式，但粪中未检测到。在大鼠的尿样中未检测到益智酮乙的原形物质(tR为7.23 min)形式，但给药缩泉胶囊后在粪便样品(tR为7.21 min)中检测到少量益智酮乙(图3)。益智醇(tR为6.96 min)的原形物质形式在给药缩泉胶囊后的尿、粪样品中可被检测(图4)。

图2 大鼠尿、粪样品中益智酮甲的MRM图谱

图3 大鼠尿、粪样品中益智酮乙的MRM图谱

图4 大鼠尿、粪样品中益智醇的MRM图谱

2.3 黄酮类成分及其代谢物的测定 大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿、粪中黄酮类成分的测定见图5～图9。未检测到益智黄酮的二相结合代谢产物。大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿(tR为7.15 min)、粪(tR为7.11 min)样品中均可检测到杨芽黄素的原形物质形式(图5)。在尿样中检测不到伊砂黄素，而给药缩泉胶囊的粪便样品中，有少量的伊砂黄素原形物质(tR为7.36 min)被检测(图6)。大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿(tR为6.01 min)、粪(tR为5.98 min)样品中均可检测到白杨素的原形物质形式(图7)。大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿(tR为 7.32 min)、粪(tR为7.28 min)样品中均可检测到芹菜素-4'，7-二甲醚的原形物质形式(图8)。大鼠灌胃缩泉丸和缩泉胶囊后，大鼠尿(tR为6.28 min)、粪(tR为6.25 min)样品中检测不到山奈素的原形物质形式(图9)。

图5 大鼠尿、粪样品中杨芽黄素的MRM图谱

图6 大鼠尿、粪样品中伊砂黄素的MRM图谱

图7 大鼠尿、粪样品中白杨素的MRM图谱

图8 大鼠尿、粪样品中芹菜素-4',7-二甲醚的MRM图谱

图9 大鼠尿、粪样品中山奈素的MRM图谱

3 讨论

我们在灌胃给药缩泉丸和缩泉胶囊后的大鼠血浆中检测到诺卡酮、益智酮甲、益智酮乙等益智成分的游离药物形式，但是益智的黄酮类成分以及二芳基庚烷类成分在大鼠体内多以二相结合代谢产物的形式存在[3]。通过本文的研究发现，所观察的9个益智活性成分，在尿中可以检测到诺卡酮、益智酮甲、益智醇、杨芽黄素、白杨素和芹菜素-4'，7-二甲醚原形物质形式。这些成分能否在尿液中蓄积到一定的药物浓度从而作用于膀胱相关靶标而引起对排尿反射的作用，有待于进一步观察。在尿液中并未检测到相关的二相代谢产物，可能是这些物质又发生了进一步的代谢。

灌胃给药后，粪便中药物的来源可能有以下途径：(1)制剂中未被吸收的部分；(2)吸收后从胆汁中排泄的部分；(3)吸收后肠道分泌的部分；(4)肠道代谢转化的部分。我们在研究益智活性成分的胆汁排泄物质形式时发现，这些物质在胆汁中主要以二相结合物的形式存在[3]。本文研究发现，在大鼠的粪便中观察到诺卡酮、益智酮乙、益智醇、杨芽黄素、白杨素和芹菜素-4'，7-二甲醚的原形物质形式，但未检测到二相结合代谢产物，说明由胆汁排泄进入肠道中的二相代谢物在肠道菌群的作用下，发生了降解反应。

[1]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation Suoquan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[2]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[3]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Identification of known chemicals and their metabolites from Alpinia oxyphylla fruit extract in rat plasma using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/ MS)with selected reaction monitoring[J].J Pharm Biomed Anal, 2014,97:166-167.

[4]陈 峰,谭银丰,赖伟勇,等.LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物[J].海南医学院学报,2014,20(5):581-587.

[5]Qing ZJ,Yong W,Hui LY,et al.Two new natural products from the fruits of Alpinia oxyphylla with inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideactivated RAW264.7 macrophage cells[J].Arch Pharm Res,2012,35(12):2143-2146.

Identification of known chemicals and their metabolites from Suoquan formula in rat urine and feces.

QIN Zhen-miao1,2,LI Hai-long1,2,TAN Yin-feng1,2,LAI Wei-yong1,2,CAI Hong-die2,ZHANG Xiao-po1,2,CHEN Feng1,2. 1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy, Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify the flavonoids(tectochrysin,izalpinin,chrysin,kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)and their metabolites,as well as diarylheptanoids(yakuchinone A,yakuchinone B and oxyphyllacinol)and their metabolites,in rat urine and feces after oral administration of Suoquan capsules or pills.MethodsAfter male Sprague Dawleyoral rats were administratered Suoquan pills(3.54 g/kg)and Suoquan capsules (3.77 g/kg),they were placed into the metabolism of the cage.Their urine and dung were collected 12 h later.The dung was weighed and added 9 volumes of deionized water and then homogenized at high speed divided method.100 μl homogenate of urine and dung were taken into centrifuge tube,with 300 μl methanol added,shaked 5 min by vortex and centrifuged 10 min at 13 000 r/min.The supernatant were drawed and dried under N2.The residue was reconstituted using 50 μl methanol liquid,shaked and centrifugated again.40 μl supernatant was drawed and analyzed by liguid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).ResultsAccording to the peak LC-MS/MS case in the biological sample of the mentioned control group,comparing the urine and dungs sample before and after the administrated Suoquan pills and Suoquan capsules,we found that the main substances detected in urine and dungs were prototype form and were not detected the phaseⅡmetabolites,such as glucuronide metabolites,in rats after intragastric administration.ConclusionNootkatone,puzzle ketone A and Young shoots flavin and other ingredients are detected in the urine of rats,which may be the active constituents in regulating the bladder and bladder function.

Suoquan Pills;Suoquan Capsules;Urinary excretion;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）23—3433—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1345

2014-06-30)

海南省自然科学基金(编号：812189，813188)；海南医学院青年培育基金(编号：HY2012-013)通讯作者：陈 峰。E-mail：cy.chen508@gmail.com