王晓琴　黄伙水　陈明　陈晓旭

摘 要 采用果胶酶开展水酶法提取茶叶籽油及茶皂素工艺研究，单因素实验探索酶量、作用温度、作用时间、料液比等对油得率及副产物茶皂素得率的影响；在此基础上开展中心组合试验，进行响应面分析对提取工艺进行优化。结果表明：回归方程为R=-61.384+0.719A+2.994B+4.829C+3.475D+0.015AB+0.075AD+0.045BC+0.065BD-0.122A2-0.040B2-0.913C2-0.663D2；最佳工艺条件为酶解温度45 ℃、 酶解时间3.8 h、 料液比1 ∶ 5.3（g ∶ mL）、果胶酶添加量7.3 mL（0.2%），验证试验茶叶籽油得率为27.0%，为茶叶籽资源开发提供了基础资料。

关键词 茶叶籽油；水酶法；果胶酶；茶皂素；响应面分析

中图分类号 TS225.16 文献标识码 A

2009年茶叶籽油被中国卫生部批准为新资源食品，Guo等[1]报道其主要含有20种脂肪酸，其中单不饱和脂肪酸的平均含量为51.06%，主要为油酸；多不饱和脂肪酸平均含量为27.86%，主要为亚油酸；饱和脂肪酸平均含量为20.67%，主要为棕榈酸和硬脂酸。另外茶叶籽油中富含多酚及生育酚（VE）等，具有较强的抗氧化能力。可见，茶叶籽油是一种可以与橄榄油媲美的食用油脂[2]。

水酶法是一种较为先进的提取工艺，“绿色、安全、高效”，在黄粉虫、花生、核桃、葡萄籽、橄榄等多种油料开发研究上已见报道，表明其对油料作物综合开发具有突出技术优势，可以提高油脂品质[3-9]。植物细胞壁主要由纤维素及果胶组成，采用降解酶破坏油料细胞壁结构，可促进细胞中油脂释放。纤维素酶应用于水酶法提取茶叶籽油笔者已做探索[10]，本研究采用果胶酶开展茶叶籽油提取工艺分析，单因素试验探索不同条件对油得率及副产物茶皂素得率的影响，在此基础上开展中心组合实验，采用响应面分析方法建立茶叶籽油水酶法提取工艺数学模型，旨在为茶叶籽综合开发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

样品材料：铁观音茶叶籽，采自安溪茶园。

试剂：果胶酶，北京索莱宝科技有限公司；无水乙醚、硫酸：国际集团化学试剂有限公司；无水乙醇：北京宗荣宝科技有限公司；香兰素、香草醛：阿拉丁公司。

主要仪器：DF-I集热式磁力搅拌器：江苏省荣华仪器制造有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵：上海贺德实验设备有限公司；V-1200型可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺流程 茶叶籽→干燥→去壳→脱衣→粉碎→称量→灭酶→冷却→酶解→二次灭酶→

油样→抽滤→称重

离心→分液

废弃液→茶皂素浓度及体积测定

1.2.2 单因素实验 果胶酶量对油得率和茶皂素得率影响：固定料液比为1 ∶ 4（g ∶ mL）、酶解温度45 ℃、酶解时间2.5 h，考察1、4、7、10、13 mL果胶酶酶溶液（0.2%）对油得率的影响，同时对提取工艺副产物茶皂素得率进行测定。

料液比对油得率和茶皂素得率影响：固定酶用量7 mL、 酶解温度45 ℃、酶解时间2.5 h，考察料液比（g ∶ mL）1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5及1 ∶ 6对油得率的影响，同时对提取工艺副产物茶皂素进行测定。

温度对油得率和茶皂素得率影响：固定酶用量7 mL、料液比1 ∶ 4、酶解时间2.5 h，考察酶解温度35、40、45、50、55 ℃对油得率的影响，同时对提取工艺副产物茶皂素进行测定。

酶解时间对油得率和茶皂素得率影响：固定酶用量7 mL、料液比1 ∶ 4、酶解温度45 ℃，考察酶解时间0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h对油得率的影响，同时对提取工艺副产物茶皂素进行测定。

1.2.3 中心组合实验 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，确定中心组合实验因素与水平，见表1。

1.2.4 测定方法 得油率/%=×100 （1）

其中：m1—提取的茶叶籽油质量（g）

m2—茶叶籽粉质量（g）

茶皂素测定采用香草醛一硫酸法[11]。

茶皂素/%=×100 （2）

其中：C—通过标准曲线由吸光度计算出此时茶皂素的浓度

V—测定时吸取的体积数

N—稀释倍数

M—被测样品重量

1.3 数据分析

采用软件Excel 2007和Design Expert 7.1.6进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 果胶酶用量对茶叶籽油和茶皂素得率的影响

由图1可知，随着果胶酶量增加，细胞壁降解程度加大，茶叶籽细胞中的油脂更多被释放出来，油得率在酶溶液1～7 mL呈现逐渐上升，在酶溶液添加量为7 mL时，油得率达到最大值24.5%，酶量继续增加导致底物相对减少，油得率的变化趋势不明显；在不同酶量条件下脱脂茶叶籽饼粕中所含茶皂素得率变化较小，随着反应酶量的增加，茶皂素得率曲线近似表现为一条逐渐上升的直线，变化幅度不大但趋势明显。因此，选择加酶量7 mL为最佳条件。

2.2 酶解温度对茶叶籽油和茶皂素得率的影响

由图2可知，随着反应温度增加，油得率先逐渐上升，酶解温度为45 ℃时，油得率达到24.2%，随着反应温度的继续增加，油得率又呈现出逐渐降低的趋势；不同温度条件下脱脂茶叶籽饼粕中所含茶皂素得率存在变化，随着反应温度的增加，茶皂素得率呈现逐渐上升趋势，变化幅度较小。

2.3 料液比对茶叶籽油和茶皂素得率的影响

由图3可知，随着料液比的改变，浆料得以稀释，酶与底物接触面积增大，作用效果明显提高，在料液比为1 ∶ 5时油得率达到最大值；而当继续增加反应体系内水分含量时，底物浓度变低，致使酶解效果减弱从而油得率下降；不同料液比条件下茶皂素得率变化幅度较大，当增加反应体系水分时，发挥了水浸法提取茶皂素的作用，料液比在1 ∶ 5、1 ∶ 6情况下茶皂素得率提高较大，最高达到9.4%。可见料液比适宜控制在1 ∶ 5。

2.4 酶解时间对茶叶籽油和茶皂素得率的影响

由图4可知，随着反应时间增加，油得率呈现出先逐渐上升，当反应时间达到3.5 h，油得率接近最大值，随着反应时间继续增加，油得率较为稳定；在不同反应时间条件下茶皂素得率整体偏低，随着反应时间的增加，茶皂素得率曲线呈现上升趋势，但没有出现峰值。为缩短时间、降低能耗，酶反应时间取3.5 h为宜。

2.5 中心组合试验结果分析

以茶叶籽油得率为响应值，应用 Design Expert7.1.6软件对中心组合试验29组试验数据（表2）进行多元回归拟合分析，得到茶叶籽油得率与各因素变量的二次方程模型为：

R=-61.384+0.719A+2.994B+4.829C+3.475D+0.015AB+0.075AD+0.045BC+0.065BD-0.122A2-0.040B2-0.913C2-0.663D2

其中，R代表茶叶籽油得率预测值，A代表酶量，B代表反应温度，C代表反应时间，D代表料液比。

对以上回归方程进行回归系数的估计及方差分析（表3），料液比和反应时间均达到极显著水平（p<0.000 1），酶用量对茶叶籽油得率的影响显著（p<0.05），且二次项对茶叶籽油得率的曲面效应极显著，p值均小于0.000 1，交叉项对得率的影响也较显著，p值均小于0.05。

决定系数 R2=0.979 3，即回归方程中所有自变量的变化可以解释97.93%的因变量变化，调整后的R2Adj=0.963 7，说明方程模型具有很高的可信度。从表3分析结果来看，整体模型p<0.000 1，表明该二次方程模型达到极显著水平，并且失拟项不显著，说明该方程与试验的拟合度较好。因此，可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

为了进一步确定果胶酶提取茶叶籽油的最佳工艺条件，对拟合的方程分别求4个变量的一阶偏导，并令其值为0，得到如下四元一次方程组：

0=0.719+0.015B+0.075D-0.244A

0=2.994+0.015A+0.045C+0.065D-0.080B

0=4.829+0.045B-1.825C

0=3.475+0.075A+0.065B-1.325D

对上述方程组求解可得最佳工艺实际参数为：酶解温度45.19 ℃、酶解时间3.76 h、料液比1 ∶ 5.25（g ∶ mL）、果胶酶添加量7.33 mL（0.2%）。在此优化条件下，茶叶籽油得率的预测值达到27.11%。为验证该工艺条件的可靠性及预测值得准确性，按照以上条件结合操作可行性进行3组验证试验，试验结果如表4所示，相对误差只有0.4%。

3 讨论与结论

果胶是细胞壁的重要组成成分，果胶酶通过降解果胶从而破坏细胞壁结构，有助于油脂等物质提取。温度对酶促反应的速率影响较大，包括影响酶的稳定程度、酶与底物的结合，酶和辅酶的结合等[12]。当温度高于45 ℃，较高的温度会抑制酶活性，从而导致油得率下降。在料液比为1 ∶ 2、1 ∶ 3的情况下，可能因为浆料粘稠度大，酶与底物接触不充分，由于过高的底物浓度，2个或者2个以上的底物分子分别占据酶分子部分的活性点，从而使酶的活性受到抑制[12]。采用果胶酶对茶叶籽油及茶皂素进行提取，单因素试验表明可实现综合开发，中心组合试验以及响应面分析对该工艺进行优化，最佳工艺条件是酶解温度45 ℃、酶解时间3.8 h、料液比1 ∶ 5.3、果胶酶添加量7.3 mL（0.2%）。在此优化条件下，验证试验茶叶籽油得率平均为27.0%。 本研究结果表明，果胶酶在茶叶籽油及茶皂素水酶法提取工艺具有一定应用潜力。在茶叶籽油水酶法提取工艺中，采用果胶酶油脂得率略高于纤维素酶（23.8%）[10]、中性蛋白酶（26.1%）[13]，然而其降解体系水油乳化现象严重，清油难以分离，制约其在水酶法提取油脂工艺上的推广价值，需要进一步探索解决破乳问题。

参考文献

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