李海林 李维国 杨朝渠

摘 要 利用MSAP技术，检测橡胶树热研8-79幼态无性系与老态无性系DNA甲基化差异。结果表明，幼态无性系的DNA甲基化水平为33.2%，老态无性系的DNA甲基化水平为22.9%，两者基因组DNA甲基化水平有一定差异，而且DNA甲基化模式也不同。对部分差异片段经同源性比对分析可知，同源序列的功能主要与代谢、细胞生长相关。这些差异可能是导致橡胶树幼态与老态无性系间性状差异的原因。

关键词 橡胶树；幼态无性系；老态无性系；MSAP

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

MSAP Analysis of Juvenile Clones and Mature

Clones of Hevea brasiliensis

LI Hailin1， LI Weiguo2，3 *， YANG Zhaoqu1

1 Horticulture Department， Taizhou Vocational College of MSAP technologyScience and Technology， Taizhou， Zhejiang 318020， China

2 State Center for Rubber Breeding， Insitute of Rubber， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan

571737， China

3 College of Agronomy，Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract The genomic DNA methylation of Hevea brasiliensis was comparatively studied with MSAP based on juvenile clones and mature clones. The results showed that the DNA methylation level of the juvenile clones was 33.2%， while that for the mature clones was 22.9%. Furthermore， the DNA methylation patterns were also different. Homology analysis for some fragment of difference revealed that the main function of homologous sequences was related eith metabolism and cell growth.

Key words Rubber； Juvenile clone； Mature clone； MSAP

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.001

橡胶树（Hevea brasiliensis）为大戟科高大乔木，在生产上，为了保持母本的优良性状，一般通过嫁接的方式繁殖。根据接穗取自母树生长部位的差异，接成的芽接苗分为幼态无性系和老态无性系[1]。从理论上说，嫁接是无性繁殖，不会导致遗传信息改变。嫁接法繁殖的后代，一般能保持母本原有性状。但是，国内外学者发现，橡胶树幼态无性系比同源的老态无性系产量高，长势好，抗逆性强[1-3]。为了研究橡胶树幼态无性系增产的分子机理，本研究利用MSAP技术从表观遗传学角度探索橡胶树无性系之间性状差异的原因。表观遗传学（epigenetics）是指在DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的遗传信息变化[4]。DNA甲基化是表观遗传学研究最深入、最重要的一种机制，已经成为当前分子生物学研究的热点。作为检测DNA甲基化的主要方法，MSAP（Methylation sensitive amplified polymorphism）即甲基化敏感扩增多态性，具有一次性检出位点多的特点，而且分析结果直接与基因序列联系起来，已成为检测植物基因组DNA甲基化的重要方法，并且已经应用在脐橙[5]、松树[6]、马占相思[7]、枇杷[8]等木本植物的基因组DNA甲基化研究中。李海林等[9-10]通过建立了橡胶树的MSAP反应体系，对橡胶树的MSAP进行了初步分析。本研究是在之前研究的基础上，利用MSAP技术分析橡胶树幼态与老态无性系间基因组DNA甲基化水平和模式的差异，探索DNA甲基化差异对橡胶树生长发育的调控机理，为进一步深入研究橡胶树幼态无性系高产的原因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 选取橡胶树热研8-79幼态无性系和老态无性系展叶期健康叶片，采自中国热带农业科学院橡胶研究所基地。

1.1.2 试剂 EcoRⅠ、HpaⅡ、MspⅠ、dNTP、RNase、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等为Fermentas公司产品；Tris、CTAB、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、葡萄糖、分子量标准（Marker）均购自上海高科生物工程有限公司；TEMED、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺为BBI公司进口分装；硝酸银购自上海生工生物工程有限公司；剥离硅烷、亲和硅烷购自北京昌盛鼎国生物技术有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 MSAP MSAP包括DNA的提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测。具体流程参照李海林等[9]的报道。接头和引物序列参见表1。

1.2.2 带型分析 HpaⅡ和 MspⅠ分别与EcoRⅠ组合进行MSAP反应时，每一个扩增位点均代表一个（CCGG/GGCC）位点，有带则计x 对MSAP扩增产物的电泳清晰条带进行统计，根据EcoRⅠ+HpaⅡ和EcoRⅠ+MspⅠ扩增条带的差异，分别统计幼态无性系与老态无性系基因组DNA甲基化水平（即总甲基化率，包括全甲基化率和半甲基化率）。再根据两者在同一位点甲基化的差异，分析二者之间DNA甲基化模式的差异。

1.2.3 差异位点回收、克隆、测序、序列比对、功能分类 将甲基化修饰位点用刀片切下，100 μL灭菌双蒸水沸水浴5 min。取2 μL上清液为扩增模板，以相应选扩引物及扩增条件进行扩增。PCR 产物进行回收、连接、转化大肠杆菌感受态细胞，挑阳性单克隆。序列测定委托华大基因（深圳）科技股份有限公司完成。所得序列用BLASTN程序在 NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行同源性检索，同源序列功能分类按照Bevan等[11]的方法分类。

2 结果与分析

2.1 DNA甲基化水平差异分析

25对引物扩增结果中，选择扩增条带清晰、多态性好的16对引物进行扩增结果统计分析，结果见表2。由表2可知，16对引物扩增总片段数为550条，其中幼态无性系262条，老态无性系288条。幼态无性系中：半甲基化带数32条，半甲基化水平为12.2%；全甲基化带数55条，全甲基化水平为21.0%。甲基化带数共87条，总甲基化水平33.2%。老态无性系中：半甲基化带数19条，半甲基化水平为6.6%；全甲基化带数47条，全甲基化水平为16.3%。甲基化带数共66条，总甲基化水平22.9%。二者相比，幼态无性系的半甲基化水平、全甲基化水平和总甲基化水平要高于老态无性系。

2.2 DNA甲基化模式差异分析

2.3 MSAP差异条带测序

对部分回收、克隆后得到的差异序列，通过比对后，同源序列是一些基因组序列。按照功能注释进行划分，差异序列的功能主要分为：代谢、细胞生长、细胞结构、不明确分类等（表4）。

3 讨论与结论

幼态无性系和老态无性系的全甲基化水平都比半甲基化水平高。由此推断，橡胶树基因组中甲基化的模式主要是以全甲基化为主，也就是以DNA双链内侧胞嘧啶（Cm5CGG）甲基化为主。这与枇杷[8]、油菜[13]的一致，和脐橙[5]的相反。说明不同植物基因组中甲基化的主要模式是不同的。此外，和老态无性系相比，幼态无性系DNA甲基化水平和模式都存在差异。模式的差异主要通过重新甲基化和去甲基化而引起。

通过对二者DNA甲基化差异条带测序和分析可知，这些序列的功能与代谢、细胞生长、细胞结构有关。差异条带DNA甲基化的变化是否导致橡胶树幼态与老态无性系性状的差别，需要进一步深入研究。

参考文献

[1] 刘松泉， 袁燮辉， 黄 香， 等. 幼态与老态无性系产量及性状比较的研究[J]. 热带作物研究， 1985（3）： 1-5.

[2] Dijkman M J. Hevea， Thirty Years of Reseach in the Far East[M]. Florida： University of Miami Press， 1951： 213-222.

[3] 陈雄庭， 王泽云， 吴蝴蝶， 等. 橡胶树新种植材料幼态自根无性系[J]. 热带作物学报， 2002， 23（1）： 19-23.

[4] 薛京伦. 表观遗传学-原理、 技术与实践[M]. 上海科学技术出版社， 2006： 11-20.

[5] 洪 柳， 邓秀新. 应用MSAP技术对脐橙品种进行DNA甲基化分析[J]. 中国农业科学， 2005， 38（11）： 2 301-2 307.

[6] Fraga M F， Canal M J， Rodriguez R.Phaes-change related epigenetic and physiological changes in Pinus radiata[J]. Planta， 2002， 215： 672-678.

[7] Baurens F C， Nicolleau J， Legavre T， et al. Genomic DNA methylation of juvenile and mature Acacia mangium micropropagated in vitro with reference to leaf morphology as a phase change marker[J]. Tree Physiol， 2004， 24（4）： 401- 407.

[8] 汪卫星. 天然与人工合成三倍体批把基因组变异及其DNA甲基化分析[D]. 重庆： 西南大学， 2008.

[9] 李海林， 李维国， 陈组兴， 等. 橡胶树MSAP技术体系的优化与建立[J]. 热带作物学报， 2011， 32（4）： 644-647.

[10] 李海林， 吴春太， 李维国. 巴西橡胶树DNA甲基化的MSAP分析[J]. 分子植物育种， 2011， 9（1）： 69-73.

[11] Bevan M， Bancroft I， Bent E， et al. Analysis of 1.9 Mb contiguous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana[J]. Nature， 1998， 39： 809-821.

[12] 张 勇， 刘朝辉， 刘 成， 等. 外源种质导入引发小麦表观遗传变异的 MSAP 分析[J]. 科学通报， 2007， 52（24）： 2 857-2 865.

[13] 陆光远， 伍晓明， 陈碧云， 等. 油菜种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析[J]. 科学通报， 2005， 50（24）： 2 750-2 756.

[14] Cervara M T， Ruin-Garcia L， Martinez-Zapater J M. Analysis of DNA methylation in Arabidopsis thaliana based on methyla-tion-sensitive AFLP markers[J]. Mol Genet Genomics， 2002， 268（4）： 543-552.