董龙等

摘 要 利用前期芒果逆境差异显示的基因数据设计引物，从四季芒基因组DNA和cDNA中克隆了1条长为1 208 bp的基因片段。生物信息学分析发现，该基因属于类黄酮磺基转移酶（flavonoid sulfotransferase）基因，在第71-334个氨基酸中包含一个保守的Sulfotransferase结构域，命名为芒果类黄酮磺基转移酶基因（MiST）。该基因编码341个氨基酸，分子量为85.14 ku，等电点为5.09，不含内含子，在不同芒果品种之间其核苷酸和氨基酸序列均高度保守。半定量表达模式分析显示，该基因在四季芒茎、叶、花和果中均有表达，但在谢花后20 d的小果和谢花后40 d的中果中的表达量较高，表明该基因可能与芒果果实中黄酮的生物合成有关。

关键词 芒果；类黄酮磺基转移酶基因；表达分析

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

Cloning and Expression Analysis of a Flavonoid Sulfotransferases Gene from Mango（Mangifera indica）

DONG Long1， LUO Cong1*， HE Xinhua1，2**， HU Ying1， YU HaiXia1

1 College of Agronomy， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004，China

2 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract Based on the early differential gene expressions database of mango stress samples， a 1 208 bp sequence was obtained. Bioinformatics analysis showed that the gene belonged to flavonoid sulfotransferase. It was named as M. indica flavonoids sulfotransferase gene（MiST） due to existing a conservative sulfotransferase domain structure between 71-334 amino acid sequence. The gene coded 341 amino acids with an estimated molecular weight and isoelectric point of 85.14 Ku and 5.09， respectively. No introns were found in the MiST DNA sequences， but the nucleotide and amino acid sequences of MiST DNA sequences were highly conserved between different mango varieties. Semi-quantitative analysis showed that the MiST gene was expressed in stems， leaves， flowers and fruits in mango， but the gene expression level in the tissue of small fruits（20 days after the fallen petal） and middle fruits（40 days after the fallen petal）was higher than that of the other tissues. These results indicted that MiST gene might be play an important role in flavonoid biosynthesis in mango fruit.

Key words Mango；Flavonoid sultransferase gene；Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.016

黄酮类化合物（Flavonoid，又称类黄酮）是一类广泛存在于植物中的多酚类天然产物，其对植物的生长、发育、开花和结果以及抵御异物入侵起着重要的作用[1]。黄酮类化合物形成后不仅有糖基化修饰，同时还存在酰基化和硫酸化修饰，从而导致黄酮类化合物种类及其功能的多样性[2]。此类化合物对人类具有保护心脑血管、降低胆固醇、抗氧化、抗菌、抗过敏、抗炎症等多种生物活性及药理作用[3-7]；而对植物其具有抗紫外辐射、吸引授粉昆虫、决定花的颜色、抵御低温胁迫、增强植物的抗病性等功能[2， 8-9]。而磺基转移酶具有底物结合和催化的功能，在调控植物解毒、植物的生长发育等方面有重要作用。同时，多个类黄酮磺基转移酶基因催化黄酮硫酸酯的生物合成[1]，在植物、动物、细菌中硫酸盐代谢中也具有重要作用[2，10-11]。这些与黄酮类化合物的硫酸化修饰关系密切。目前，类黄酮磺基转移酶基因在动物和人类中研究比较深入，而在植物中研究相对较少，在拟南芥[2，12-13]、菊花[14]和甘蓝型油菜[15]中有报道，在芒果等木本植物中的研究鲜有报道。

芒果是重要的热带水果之一，广受消费者的欢迎，并且其果肉富含天然的抗氧化类物质，如抗坏血酸、类胡萝卜素、黄酮等[16]。目前黄酮类化合物的生物合成一直是植物次生代谢基因工程中一个重要研究课题，芒果类黄酮已有生理生化方面的研究报道[17]，但分子生物学方面尚未见相关报道。本试验以四季芒逆境胁迫样品的差异显示数据为基础，筛选并克隆获得一个基因，经比对确认该基因为芒果类黄酮磺基转移酶基因（Mangifera indica flavonoid sulfotransferase，MiST），对其cDNA和DNA全长序列进行生物信息学分析，并分析其在四季芒不同组织中的表达模式，旨在为芒果黄酮类化合物的生物合成机制和类黄酮磺基转移酶基因后续的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：四季芒叶片、花、果实、茎以及凯特、台农一号和桂热82号植株的叶片；供试材料均采自于广西大学农学院果树标本园。

试剂和仪器：M-MLV逆转录酶、EX Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素、pMD18-T 载体均购自大连TaKaRa公司；大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖、引物合成以及测序均来自上海生工生物工程技术服务有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自杭州博日公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA及RNA的提取 四季芒、凯特、台农一号和桂热82号芒果成熟叶片基因组DNA的提取采用改良CTAB法[18]。芒果总RNA的提取采用热硼酸法。分别提取四季芒老叶、嫩叶、初花、盛花、小果（谢花后20 d）、中果（谢花后40 d）、大果（谢花后60 d）、嫩茎、老茎等材料的总RNA。最后用紫外分光光度计测定其纯度和浓度并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.2 cDNA 第一链的合成 以AUP1：GGCCAC

GCGTCGACTAGTAC（T）18为逆转录引物，用M-MLV逆转录酶进行cDNA第一链的合成，合成方法步骤参照说明书进行。用紫外分光光度计测定逆转录产物的浓度，并用琼脂糖电泳检测逆转录效果，最后把cDNA第一链产物配成200 ng/μL标准浓度用于PCR扩增。

1.2.3 芒果MiST同源基因全长克隆 课题组前期对四季芒不同逆境胁迫处理样品进行基因差异显示研究，获得芒果MiST同源基因的全长序列。在MiST基因的起始密码子附近设计引物QSTu，下游引物为逆转录加尾引物3side，用于芒果MiST同源基因cDNA全长的克隆；在终止密码子附近设计下游引物QSTd，与上游引物QSTu进行DNA扩增，获得芒果MiST同源基因DNA全长序列。芒果ST同源基因cDNA扩增PCR体系如下：总体积为25 μL，其中buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下游引物各为1 μL；dNTP 0.5 μL；Dream Taq聚合酶0.16 μL；ddH2O 18.84 μL。PCR扩增参数为：95 °C预变性5 min；95 °C变性40 s；57 °C退火40 s；72 °C延伸90 s；共38个循环；72 °C延伸8 min。芒果ST同源基因DNA扩增PCR体系与cDNA扩增体系相同。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。用Biospin Gel Extraction Kit回收克隆的目的片段，胶回收产物连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄霉素筛选阳性菌落，经PCR验证后，送上海宝生物工程有限公司测序。合成的引物序列如下：

QSTu： CAATGGTTTACACAAGAACCCAAT

QSTd： TGTTCGTCCTGACTCTTCCTAC

3side： GGCCACGCGTCGACTAGTAC

1.2.4 芒果MiST同源基因序列分析 将芒果MiST同源基因提交美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），用Blast检索基因的相似性；用BioXM2.6进行氨基酸序列预测；利用在线分析软件 Protparam分析氨基酸序列的理化性质；利用在线分析工具GENSCAN对该基因的核苷酸序列进行分析；利用在线分析工具SOSUI的神经网络算法对其蛋白进行预测；用ScanProsite和SMART对氨基酸序列的结构域进行预测；用GOR4分析MiST蛋白的二级结构；用3D-JIGSAW对氨基酸的三级结构进行预测分析，并用RasMol2.7进行三级结构显示；用MEGA5.0软件，选择连接近邻算法构建多物种MiST同源基因推测蛋白系统进化树。

1.2.5 芒果MiST基因在不同组织器官的表达分析

通过半定量RT-PCR方法探讨芒果MiST基因在四季芒不同组织器官中的表达情况。内参基因选用芒果Actin1基因[19]。半定量PCR体系如下：总体系为25 μL，包含buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；上下游引物各为1 μL；dNTP 0.5 μL；Dream Taq聚合酶0.16 μL；ddH2O 18.84 μL）。PCR扩增参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共32个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。内参引物及半定量特异引物设计如下所示：

半SActinU1： GTTTCCCAGTATTGTGGGTAGG

半SActinD1： AGATCTTTTCCATATCATCCCAGTT

半ST2U： TTAGCCACAATACCGAAATCAGG

半ST2D： CTCCCAAAATGGACCGAACCC

2 结果与分析

2.1 芒果MiST基因全长克隆

利用引物QSTu和QSTd对四季芒混合cDNA模板进行PCR扩增，成功获得长度为1 208 bp的MiST基因全长cDNA序列及推测氨基酸序列（图1），基因登陆号为HQ586002。

2.2 序列分析

MiST基因序列全长1 208 bp，包括一个1 023 bp的开放阅读框，编码341个氨基酸（图1）。利用分子生物学分析软件BioXM 2.6对克隆得到的4个芒果品种的MiST基因DNA序列进行比对结果表明，这4个芒果品种的MiST基因序列高度保守，有8个位点的碱基差异，翻译的氨基酸序列有5个位点的氨基酸不一致。

MiST基因的核酸和氨基酸序列分别在NCBI中进行BLAST分析，发现该基因的核酸序列与杨树（Populus trichocarpa）同源性较高，氨基酸序列与可可树（Theobroma）同源性较高。利用在线分析软件Protparam对芒果MiST的氨基酸序列理化性质分析发现，该蛋白质的分子式为C3152H5283N1023O1322S202，分子质量为85.14 Ku，等电点为5.09。编码蛋白的不稳定系数（Instability index）为36.33，总平均疏水性为0.748，预测为稳定的疏水蛋白。预测该蛋白的预估半衰期为4.4。

利用在线分析软件对该基因进行生物信息学分析结果如表1，其中用四季芒的cDNA和gDNA克隆得到ST基因的大小和序列比对相同，表明该基因不含有内含子。这和软件GENSCAN分析结果一致，该基因只有一个外显子。由表2可知，该蛋白具有较多的蛋白激酶C磷酸化位点，推测该基因可能参与糖代谢控制，其他基因的表达调控。通过不同在线分析软件对MiST蛋白的二级结构和三级结构（图2）的分析比较，结果基本吻合，说明软件分析结果具有可信度。

用MEGA5.0软件对芒果MiST蛋白的氨基酸序列与多种不同植物ST蛋白的氨基酸序列进行系统进化树分析结果如图3，发现芒果MiST蛋白与可可树的ST蛋白关系最近。

2.3 芒果不同组织不同发育时期MiST表达水平差异分析

以芒果Actin1基因为内参基因（32个循环），采用半定量RT-PCR的方法分析芒果MiST基因在嫩茎、老茎、嫩叶、老叶、初花、盛花、小果、中果、大果（约8成熟果实）中的表达模式。其中内参基因和目的基因半定量扩增的目的条带大小分别为168 bp、423 bp。由图4可知，芒果MiST基因在茎、叶、花、果中均有表达，在嫩叶、老叶和大果的表达量较低，在小果和中果中的表达量比其他组织均高，但在嫩茎、老茎、初花和盛花的组织里面表达基本一致维持在中等水平。说明MiST基因在芒果地上部分的每个器官都有表达，但表达量有明显差异。

3 讨论与结论

目前发现的黄酮类化合物已超过1万多种，由于黄酮类化合物种类繁多和具有广泛的药理活性，使国内外许多学者对其产生了浓厚的兴趣。

在模式植物拟南芥中已发现18个ST基因成员[2]，但不同ST基因成员其表达模式及其功能存在很大的差异。RaRO47拟南芥的一个ST基因，其在两2小苗中表达水平最高，而在根中不表达，在4周和5周的莲座叶和花中少量表达，在第7周的成熟果荚中也表达，重金属、茉莉酸甲酯、水杨酸以及微生物浸染均诱导其表达[13]。本试验中，芒果MiST基因在四季芒茎、叶、花和不同发育时期的果中均有表达，但不同样品之间表达量存在明显差异，其中在小果和中果中表达量最高，其次是初花、盛花、嫩茎、老茎，在老叶、嫩叶和大果中的表达量最低，芒果MiST基因与拟南芥的AtST基因表达模式存在差异。Maciel等[17]对3个不同芒果品种不同发育时期果实中黄酮含量进行测定分析结果显示，在未成熟果实中的黄酮含量显著高于即将成熟果实和已成熟果实。而本试验中芒果MiST基因在未成熟果实中的表达水平显著高于即将成熟果实，说明芒果MiST基因的表达模式可能与黄酮类化合物的生物合成和分布存在密切关系。

本试验首次从四季芒中分离克隆到一个芒果MiST基因cDNA和DNA全长序列，对该基因进行生物信息学分析，发现其具有典型的磺基转移酶结构域，并且含有较多的蛋白激酶C磷酸化位点，推测该基因可能对糖代谢调控、其他基因功能调控等有关，但具体机制需要进一步研究。利用半定量RT-PCR方法对该基因在芒果不同组织中的表达特性进行了比较分析，为进一步深入研究芒果黄酮类物质在不同组织中生物合成的理化指标提供参考，同时该研究结果也可为该基因的表达途径、生物合成机制、生物活性等方面提供有用信息，从而能更充分地利用芒果黄酮类物质为植物抗性防御和人类疾病研究服务。

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