张义　阳江华　梁启福　唐朝荣

摘 要 利用DSN（duplex-specific nuclease）技术构建胶乳均一化cDNA酵母表达文库，为大规模文库筛选实验和发掘重要的低丰度表达基因，以及研究橡胶树胶乳中蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系奠定基础。

关键词 巴西橡胶树；胶乳；均一化cDNA；酵母表达文库

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

橡胶树的产量形成涉及到各种复杂的生理生化及分子调控机理，其中包括了大量与产胶排胶相关的蛋白质之间的相互作用关系。研究这些相互作用关系将有助于揭示橡胶树产量形成的分子调控机理。酵母双杂交技术是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用关系的有效工具[2]，构建高质量的cDNA酵母表达文库是该技术成功应用的关键[3]。前期研究构建了酵母单杂交文库（未发表），筛库后得到了大量的假阳性克隆，其中高达50%的假阳性克隆是Hevein、Rubber abundant protein、Rubber elongation factor（REF）、Small rubber particle protein（SRPP）、Ribosomal protein等胶乳中高丰度表达的基因[4]。大量假阳性克隆增加了后续鉴定工作的难度，甚至导致整个实验失败。为解决这一问题，采取降低文库中高丰度表达基因的相对比例，即构建胶乳均一化cDNA酵母表达文库。

已知的均一化cDNA文库构建技术可分为3种策略。其一是利用基因组DNA上功能基因拷贝数的相对均一化性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交降低高丰度基因在文库中的比例。曾日中等[5]利用此策略构建了胶乳均一化全长cDNA文库，均一化处理后，占胶乳转录本30%的REF和SRPP基因丰度降低了约1 000倍。其二是基于寡核苷酸指纹图谱法的均一化技术[6-7]，使用上百种标记的寡核苷酸探针与来自原始cDNA文库中上万个克隆的DNA分别进行芯片杂交，然后对所有克隆的杂交结果进行聚类分析，从而剔除相同克隆实现均一化。其三是复性式均一化技术[8-9]，该技术基于复性动力学理论，变性的单链DNA或mRNA分子，其浓度越大，复性时消失速度也越快。通过变性及复性操作，随着复性时间的延长，体系内各种单链cDNA或mRNA的浓度将趋于一致，再把均一化的单链cDNA或mRNA分离出来，从而构建均一化的cDNA文库。比较而言，第一种策略通常需要构建DNA 固定化亲和体系，对cDNA进行亲和杂交，实验成本较高，步骤多，对技术掌握要求较高。同时，低丰度表达基因可能会因cDNA丰度太低而未被杂交。第二种策略工作量大，设备试剂要求高，自动化程度要求高，比较昂贵。而第三种策略可以利用双链特异性核酸酶（DSN）来降解复性后体系中的双链cDNA，留下丰度较为一致的各种单链cDNA分子[10]。再以此为模板进行聚合酶链式反应，得到大量丰度比较一致的双链cDNA分子。由此可知，DSN技术简单快速，成本低，处理步骤少，容易掌握，文库质量也更为可靠。因此，DSN 技术已广泛应用在拟南芥、大麦、棉花、水稻、木薯、大豆和香蕉等植物的均一化cDNA文库构建中[11]。本研究利用DSN技术构建胶乳均一化cDNA酵母表达文库，从而有利于进行大规模文库筛选实验和发掘重要的低丰度表达基因，为研究橡胶树胶乳中蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

巴西橡胶树无性系热研7-33-97，定植于中国热带农业科学院试验场二队，采用S/2 d3不刺激割制。GenEluteTM mRNA Miniprep Kit购自Sigma aldrich公司；Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System购自Clontech公司；DSN购自Evrogen JSC 公司。

1.2 方法

1.2.1 橡胶树胶乳总RNA提取 胶乳中总RNA提取采用本实验室的改良方法[12]，利用GenEluteTM mRNA Miniprep Kit试剂盒纯化mRNA。

1.2.2 SMART cDNA文库的构建 利用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System试剂盒构建cDNA文库。首先取0.1 μg胶乳mRNA为模板，进行反转录得到两端分别带有接头的第一链cDNA，然后取1 μL反转录产物为模板，用试剂盒内的引物5′ PCR Primer和3′ PCR Primer对其进行LD-PCR（Long Distance PCR），总体系50 μL。反应程序：98 ℃变性10 s，68 ℃退火及延伸6 min，18个循环。反应结束后取7 μL的PCR产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 cDNA文库均一化处理 采用Clontech公司的CHROMA SPIN+TE-400 columns纯化上述PCR产物。乙醇和醋酸钠沉淀后，用灭过菌的Mini-Q水溶解，调整其浓度为100 ng/μL。参考Trimmer-Director Kit（Evrogen，Cat.No.NK002）的操作说明书及张石柱等[13]的方法，取1 μL cDNA，加入1 μL杂交缓冲液[200 mmol/L HEPES（pH为7.5），2 mol/L NaCl，0.8 mmol/L EDTA]、2 μL Mini-Q水，1滴矿物油。98 ℃变性3 min，68 ℃复性5 h后，加入5 μL 68 ℃预热的2×DSN buffer[100 mmol/L TrisHCl（pH8.0），10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L dithio-threitol]，最后加入0.5 U DSN，用酶溶剂补足至10 μL。68 ℃处理20 min，加入10 μL 5 mmol/L EDTA终止反应。

取1 μL上述反应的混合物作为模板，用5′ PCR Primer和3′ PCR Primer重新对其进行LD-PCR，50 μL体系。同上反应条件，但15个循环。反应结束后取7 μL PCR产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 cDNA文库质量鉴定 半定量PCR检测均一化效果。橡胶延伸因子（REF）[14]为胶乳中高丰度表达基因，理论上均一化后其丰度应该降低；而HbSUT3[15]为胶乳低丰度或中等丰度表达基因，均一化后丰度升高或不变。取等量（约10 ng）均一化前后cDNA作为模板，分别扩增REF基因和HbSUT3来检测均一化效果。REF基因上游引物为P3：5′-CGATTATGGCTGAAGACGAA-3′，下游引物为P4：5′-CAAACGAAAACATAGTCTCAACAC-3′，退火温度为58 ℃，扩增片段长度为500 bp，12个循环。HbSUT3上游引物为P5：5′-CAAATCCGACCC

AACTATGTAC-3′，下游引物为P6：5′-GCAGCAT

AACCGATAAGG-3′，退火温度58 ℃，扩增片段长度为500 bp，22个循环。

1.2.5 cDNA酵母表达文库的构建 参照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System说明书，制作Y187感受态细胞。取4 μg均一化cDNA和3 μg线性化酵母表达质粒pGADT7-Rec共转化Y187菌株，涂布190个直径12 cm的SD/-Leu固体培养基平板。同时分别取稀释了10、100、1 000倍的转化液100 μL涂布SD/-Leu固体培养基平板，用于计算文库总容量和酵母转化效率。

文库总容量=平板上的菌落数×稀释倍数×转化液总体积/（100 μL）；酵母转化效率=文库总容量/（3 μg）。 平板于30 ℃培养箱内培养3 d后，用YPDA液体培养基收集平板上所有的菌体，调整好菌浓度至107 cfu/mL以上（可用分光光度计估测菌浓度，OD600=1时，菌浓度约为1×107 cfu/mL），然后分装在终浓度为25%的甘油中-80 ℃保存。

1.2.6 cDNA酵母表达文库滴度检测 各取稀释了1 000、10 000、100 000倍的文库样品100 μL，分别涂布于SD/-Leu固体培养基平板上。30 ℃培养3 d后计数白色菌落数，并计算文库滴度。

文库滴度=平板上菌落数×稀释倍数/菌液体积。

1.2.7 酵母表达文库重组率的鉴定 随机挑取48个克隆进行菌落平均插入片段及重组率的鉴定。PCR反应条件为：98 ℃变性10 s，68 ℃退火及延伸6 min，共30个循环。菌落PCR上游引物为P7：5′-ATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAA-3′，下游引物为P8：5′-ACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCT

ACGA-3′。

重组率=插入片段大于400 bp的反应个数/反应总数×100%。

2 结果与分析

2.1 均一化cDNA文库的构建

均一化前后的cDNA琼脂糖凝胶电泳检测结果显示（图1），cDNA大小主要集中在0.5 kb到3 kb之间。均一化处理前cDNA泳道中有一些高亮度的特异性条带（箭头所示），均一化后的cDNA呈现为均匀的弥散条带（图1）。利用RT-PCR进一步分析均一化处理的效果，结果显示（图2）：均一化前后22个PCR循环均能扩增出明显的HbSUT3条带，且亮度相近，表明均一化对低丰度表达基因无明显影响；但对高丰度表达REF的基因而言，均一化处理后的效果很明显，处理前12个循环能扩增出明显的条带，但处理后12个循环的扩增检测不到产物，表明均一化处理后REF基因的丰度大大降低。

2.2 cDNA酵母表达文库的构建

用于统计文库容量及酵母转化效率所涂的3个梯度稀释培养皿中，稀释100倍的培养皿上长了270个菌落。稀释10倍所涂的培养皿上菌落过于密集不便计数，而稀释1 000倍所涂的培养皿上菌落数较少，统计结果可能误差较大。所以笔者以稀释100倍所涂培养皿上生长的菌斑数量来计算库容量及转化效率。库容量为270×100×（15 mL/100 μL）≈4×106 cfu，酵母的转化效率为4×106 cfu/3μg≈1.3×106 cfu/μg。用于检测cDNA与酵母表达质粒的重组效率而随机挑选的48个菌落中，只有2个克隆为空载。所以重组率为46/48×100%≈96%，插入片段平均大小在1 kb以上（图3）。用于统计文库滴度所涂的3个梯度稀释培养皿中，只有稀释100 000倍后所涂平板上的菌落数便于统计，菌落数量为350个，所以文库滴度为350×100 000/100 μL=3.5×108 cfu/mL。

3 讨论与结论

笔者用DSN技术处理cDNA后，REF基因的丰度大幅下降。以均一化前的cDNA为模板扩增REF基因，经12个循环扩增后就可以得到较亮的条带，而以等量的均一化后的cDNA为模板扩增REF基因，经12个循环扩增后电泳无法检测到目的条带（图2），23个扩增循环后才可见比较亮的条带（亮度仍然没有以均一化前12个循环扩增所得到的条带亮）。根据不同扩增循环数电泳条带亮度变化，将REF基因的半定量扩增引物效率估算为1.9，则均一化处理后，REF基因的丰度下降了1.911以上，即均一化处理后胶乳cDNA中的高丰度表达基因的丰度下降了1 000倍以上，这与曾日中[5]的cDNA文库均一化效果相近，说明均一化效果很好。

目前市场上还没有商品化的橡胶树cDNA酵母表达文库出售。邓治等[16]用SMART方法构建了橡胶树胶乳cDNA酵母表达文库，并以HbMybl为诱饵，从胶乳cDNA文库中筛选到10个与HbMyb1可能有相互作用的克隆，其中包括REF和SRPP。考虑到REF基因和SRPP基因占胶乳总mRNA的30%左右[5]，笔者推测这2个基因可能是假阳性克隆，与本实验室的酵母单杂交实验中大量假阳性克隆结果一致。若利用本研究所构建的均一化cDNA酵母表达文库，可能避免出现过多的假阳性结果。

本研究结合了SMART和DSN技术，构建了高质量的橡胶树胶乳均一化cDNA酵母表达文库。文库中有cDNA插入片段的重组克隆比例高，插入片段较长，同时高丰度表达基因在文库中的比例被降低了约1 000倍。该文库用于酵母双杂交实验将大大提高酵母双杂交实验的成功率，为研究橡胶树乳管细胞中蛋白质与蛋白质之间相互作用关系、筛选重要蛋白的互作调控蛋白奠定基础。

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责任编辑：赵军明