张永帅,王淼焱,孙俊良,梁新红,张婷

（河南科技学院,河南 新乡 453003）

NO对黄曲霉产毒的影响研究

张永帅,王淼焱,孙俊良,梁新红,张婷

（河南科技学院,河南 新乡 453003）

研究了不同浓度NO供体SNP和NO清除剂cPTIO对黄曲霉菌产毒的影响.结果表明：在黄曲霉培养过程中添加SNP能导致黄曲霉菌体内NO量增多,产毒量减少；当添加NO清除剂cPTIO时黄曲霉菌体内NO量降低,产毒量增加.SNP浓度为0.200 mmol/L时,黄曲霉产黄曲霉毒素的量为0.87 μg/mL,比不添加时降低了16.35 μg/mL,而且添加SNP的黄曲霉菌体NO荧光值明显增高.说明NO对黄曲霉产毒有一定的抑制作用.

黄曲霉；黄曲霉毒素；NO；抑制作用

黄曲霉毒素（aflatoxin）,也称作黄曲霉素,是一种有强烈生物毒性的化合物,常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生,如大米、豆类、花生等,是迄今为止所知最强的致癌物质之一[1-4].黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种,又以B1的毒性最强.食米储存不当,极易发霉变黄,产生黄曲霉毒素.黄曲霉毒素与肝癌有密切关系,还会引起组织失血、厌食等症状[5].1960年在英国发生了因喂食黄曲霉毒素花生粕而导致大批火鸡暴毙事件.警惕黄曲霉毒素的危害,要注意剔除霉变的食物颗粒,还可采用以水淘洗的办法进一步净化易沾染的食物中的霉菌.当然,用高温烧、炸至280℃以上也可以达到分解毒素和去除污染的效果.黄曲霉是产生黄曲霉毒素的主要菌种之一,因而,研究调控黄曲霉产毒机理成为当今热点[6].

人们一直在致力寻找防治黄曲霉的方法,特别是2011年国家质检总局查出蒙牛产品黄曲霉毒素M超标,迫使我们亟需寻求一个能够有效控制黄曲霉污染的方法.自20世纪70年代以来,很多学者尝试通过改良栽培技术、使用化学药剂和生物控制等方法来克服这一棘手问题[7-9].NO作为人体内的信使分子,它不需要任何中介机制就可快速扩散通过生物膜,将一个细胞产生的信息传递到它周围的细胞中,主要影响因素是它的生物半衰期.具有多种生物功能的原因在于它是自由基,极易参与传递电子反应,加入机体的氧化还原过程中.分子的配位性又使它与血红素铁和非血红素铁具有很高的亲合力,以取代O2和CO2的位置.据研究报道,血红蛋白-NO可以失去它附近的碱基而变成自由的原血红素-NO,这就意味着自由的碱基可以自由地参与催化反应,自由的蛋白质可以自由地改变构象,自由的血红素可以自由地从蛋白中扩散出去,这三种变化中的任何一个或它们的组合,将在鸟苷酸环化酶的活化过程中起重要作用.NO的生物学作用和其作用机制研究方兴未艾,它的发现提示着无机分子在医学领域中研究的前景.

有些报道还提出NO参与植物的调节[10],那么NO是否参加黄曲霉产毒的调控呢？这个问题至今还未见报道.本研究通过使用NO的供体SPN、NO清除剂cPTIO、NO荧光探针等方法来研究NO对黄曲霉产毒的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄曲霉模式菌株,购自中国工业微生物菌种管理保藏中心；黄曲霉毒素B1（aflatoxinB1AFB1）,由江苏省农业科学院赠送；乙腈、甲醇、AFB1标准品为色谱纯,其余试剂均为分析纯.

VariosKan Flash（美国Thermo公司）；2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BM-38XBV荧光显微镜（日本尼康公司）；SW-CJ-1D单人单面垂直送风（经济型）净化工作台（中国苏州智净净化有限公司）；MTN-2800W氮吹仪（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；Heidolph VV2000旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；ZHWI-Z11C恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；SHP型生化培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海中安医疗器械厂）.

1.2 试验方法

1.2.1 孢子悬浮液制备 取保存的黄曲霉菌接种于PDA平板上,30℃下培养4 d,待黄曲霉长满平板后,将无菌Tritonx-100（0.1%）5 mL注入平板,轻摇使黄曲霉孢子均匀分散,取悬液用血球计数板在显微镜下计数,稀释成1×106CFU/mL待用,黄曲霉孢子要现制现用[11].

1.2.2 不同浓度SNP下黄曲霉产毒量的测定 在灭好菌的沙氏培养基中添加不同浓度的SNP,使其最终浓度分别为0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300、0.400、0.600、0.800、1.000和1.200 mmol/L,将制备好的孢子悬浮液接种于沙氏培养基中,30℃培养48 h,待测.

1.2.3 不同浓度NO清除剂cPTIO 下黄曲霉产毒量的测定在灭好菌的沙氏培养基中添加不同浓度的cPTIO,使其最终浓度分别为0.100、0.150和0.200 mmol/L,将制备好的孢子悬浮液接种于沙氏培养基中, 30℃培养48 h,待测.

1.2.4 AFB1提取及含量测定 吸取一定量提取液,加3倍氯仿萃取,萃取液于60℃用氮吹仪吹干,溶解在甲醇中,过0.22 m微孔滤膜,然后用HPLC测定.色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-ⅠⅠPacked Column（4.6 mmI.D.×250 mm）（上海泉岛公司）；柱温：22℃；进样量：10 μL；检测波长：365 nm；流动相：V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=1∶1∶2；流速：1 mL/min[12].

1.2.5 NO荧光值的测定 在3瓶灭好菌的沙氏培养基中分别添加等量的无菌水、SNP、cPTIO,使其SNP和cPTIO最终浓度分别为0.250、0.100 mmol/L,将制备好的孢子悬浮液接种于沙氏培养基中,30℃培养48 h,分别取3种菌液1 mL放入1.5 mL离心管中,每管添加5 μL DAF-FM溶液,混匀,取2 μL混合液滴到载玻片上,盖上盖玻片在荧光显微镜上观察拍照.另外分别取200 μL混合液放入96孔板A01-A03用VariosKan Flash在激发波长495 nm,发射波长515 nm下测荧光值.

1.3 数据分析

试验重复3次,AFB1产量平均值利用SPSS软件平台中SNK法进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 SNP对黄曲霉产毒的影响

SPN添加量对黄曲霉毒素抑制率的影响见图1.SNP添加量对黄曲霉产毒量的影响见图2.

图1 SNP对黄曲霉毒素抑制率的影响Fig.1 The effect of SNP on aflatoxin inhibition rate

图2 SNP对黄曲霉毒素产量的影响Fig.2 The effect of SNP on aflatoxin production

由图1可知,当SNP添加浓度为0.200 mmol/L时对黄曲霉产黄曲霉毒素的抑制率为64%,SNP添加浓度≥0.4 mmol/L时对黄曲霉产毒的抑制率均为100%.由图2可知,不加SNP的黄曲霉产毒量为17.28 μg/mL,SNP添加浓度为0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275和0.300 mmol/L时黄曲霉的产毒量分别为7.80、11.53、0.87、2.79、4.98、6.73和10.22 μg/mL,与对照相比添加SNP的黄曲霉产毒量都有所下降,SNP浓度为0.200 mmol/L时黄曲霉产毒量最小为0.87 μg/mL,远远低于对照的产毒量,说明SNP确实参与了黄曲霉产毒的调控.

2.2 NO清除剂cPTIO对黄曲霉产毒的影响

NO清除剂cPTIO添加量对黄曲霉产毒的影响见图3.

图3 NO清除剂cPTIO对黄曲霉产毒的影响Fig.3 The effect of NO scavenger cPTIO on aflatoxin toxin-producing

由图3可知,添加NO清除剂cPTIO的浓度为0.100、0.150和0.200 mmol/L时黄曲霉产毒素的量分别为20.56、21.74和21.73 μg/mL,不添加NO清除剂cPTIO（对照）的黄曲霉产毒素的量为17.22 μg/mL.添加NO清除剂cPTIO后黄曲霉产毒素量增加,说明NO参与调控黄曲霉产毒.

2.3 不同处理下黄曲霉菌体内NO荧光值的变化

3种处理下黄曲霉菌体内NO荧光强度的变化见图4.

图4 不同处理下黄曲霉菌体内NO的荧光强度Fig.4 The fluorescence intensity of NO in Aspergillus flavus under different treatments

由图4可知,添加SNP的浓度为0.250 mmol/L时黄曲霉菌体在荧光显微镜下可以看到明显的荧光；对照黄曲霉菌体在荧光显微镜下可以看到微弱的荧光值；而添加NO清除剂cPTIO的黄曲霉菌体在荧光显微镜下没有看到荧光.

3种处理下黄曲霉荧光值的变化见图5.

图5 不同处理下黄曲霉的荧光值Fig.5 The aflatoxin fluorescence value under different treatments

由图5可知,添加SNP的浓度为0.250 mmol/L时黄曲霉菌体用VariosKan Flash在激发波长495 nm.发射波长515 nm下测得DAF-FM荧光值为66.87；对照黄曲霉菌体测得DAF-FM荧光值为24.1；而添加NO清除剂cPTIO的黄曲霉菌体荧光值为0.

3 结论

在黄曲霉培养过程中添加SNP能导致黄曲霉菌体NO量增强,导致黄曲霉产毒量减少；当添加NO清除剂cPTIO时黄曲霉菌体NO量减弱,导致黄曲霉产毒量增加；当SNP添加量在0.200 mmol/L时,黄曲霉产毒素的量为0.87 μg/mL,比不添加时降低了16.35 μg/mL.说明NO抑制黄曲霉产生毒素,其机理还需要进一步研究.

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（责任编辑：邓天福）

Effect of NO on aftatoxin production of Aspergillus flavus

Zhang Yongshuai,Wang Miaoyan,Sun Junliang,Liang Xinhong,Zhang Ting
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The effects of different concentrations of NO donor SNP andNO scavenger cPTIO on aflatoxin production ofA spergillus flavuswas weinvestigated in this study.The results showed that：SNP is added in the process ofA.flavustraining can lead to NO increase in the number of quantity,reduce the amount of aflatoxin toxinproducing,A.flavusNO amount reduced and leading toA.flavustoxin-producing quantity increase when adding NO scavenger cPTIO,A spergillus flavusproducing aflatoxin is 0.87 μg/mL,lower than when no added（including 16.35μg/mL）and add the SNPA.flavusNO fluorescence value is significantly increased when the amount of addition of SNP is 0.200 mmol.NO toA.flavustoxin-producing has certain inhibitory effect.

Aspergillus flavus；aflatoxin；NO；inhibition

TS201.3

A

1008-7516（2014）03-0026-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.03.006

2014-05-04

国家自然科学基金项目（311641/C200101）；河南省科技计划项目（122102110037）

张永帅（1987-）,男,河南许昌人,硕士研究生.主要从事食品生物技术研究.

孙俊良（1964-）,男,河南新乡人,博士,教授,硕士生导师.主要从事食品生物技术与酶制剂工程研究.