卢国彦，杨红云，王少峡，胡利民

（天津中医药大学重点实验室，现代中药发现国家重点实验室，天津市中药药理学重点实验室，教育部方剂学重点实验室，天津 300193）

·实验研究·

心脑舒通及其单体成分对内毒素激活的小胶质细胞的影响*

卢国彦，杨红云，王少峡，胡利民

（天津中医药大学重点实验室，现代中药发现国家重点实验室，天津市中药药理学重点实验室，教育部方剂学重点实验室，天津 300193）

[目的]研究心脑舒通及其单体成分对小胶质细胞（BV-2）的影响及其作用机制。[方法]实验分为对照组、脂多糖刺激组、加药组，检测心脑舒通（不同稀释倍数的心脑舒通及其单体成分）对小胶质细胞活力及脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞一氧化氮（NO）产生的影响。[结果]心脑舒通对LPS诱导的小胶质细胞NO的产生无明显抑制作用，在心脑舒通13种单体成分中，伪原薯蓣皂苷、支脱皂苷元、薯蓣皂苷元可以在不影响细胞活力的情况下抑制NO产生。[结论]心脑舒通部分单体成分抑制激活小胶质细胞NO的产生可能是心脑舒通发挥神经保护作用机制之一。

心脑舒通；一氧化氮；炎性介质；小胶质细胞

小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，具有免疫防御和参与中枢神经系统的炎症反应，且具有吞噬功能和一定的迁移能力，激活增殖后，可清除脑内细胞外的氧化蛋白，吞噬细胞碎屑和破碎的髓鞘，促进组织修复[1]。在生理条件下，休眠的小胶质细胞有平衡神经系统和支持神经细胞的重要作用。抑制小胶质细胞过度活化所引起的炎症反应可以作为治疗和缓解神经退行性疾病和脑损伤的重要途径之一[2-3]。

心脑舒通成分为蒺藜总皂苷，具有舒利血脉、平肝解郁、活血祛风的药理作用，现代研究发现蒺藜皂苷有降血脂、抗衰老、抗脂质过氧化作用，有改善脑循环，保护缺血脑组织的作用等[4]，其作用机制尚不明确。本实验采用脂多糖（LPS）激活小胶质细胞，考察其抗神经炎症的作用及物质基础。

1 材料与方法

1.1 试剂小胶质细胞系BV-2（北京协和医科大学），心脑舒通（吉林敖东股份有限公司），（25R）－26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋甾-3β，22α，26-三醇-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷（L1化合物）、海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷（L2化合物）、(25R)-5α-螺甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷和(25R)-5α-螺甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)] -β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的混合物（L3化合物）、替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡糖基(1→4)-[α-L-鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷（L4化合物）（马百平老师惠赠），其他心脑舒通单体（中新药业），DMEM培养基、胎牛血清（Gibco,USA），一氧化氮（NO）检测试剂盒（碧云天），Cell CountingKit-8（CCK-8，DOJINDO，Japan），LPS（碧云天）。1.2实验分组空白对照组（二甲基亚砜，终浓度V/V 1∶1 000）、LPS模型组（终浓度0.1 μg/mL）、心脑舒通（终浓度为50、10、1、0.1 μg/mL）加LPS组、心脑舒通单体（10 μmol/L）加LPS组、阳性对照（终浓度为10 μmol/L）加LPS组。

1.3心脑舒通对小胶质细胞活力的影响调整细胞浓度为4×105个/mL，接种到96孔板过夜，小胶质细胞加入不同浓度的心脑舒通（终浓度分别为50、10、1、0.1 μg/mL）及其单体（10 μmol/L）孵育24 h后弃上清，加入CCK-8（终浓度V/V 1∶10）孵育0.5 h后于450 nm处测定吸光度。

1.4 心脑舒通对小胶质细胞NO产生的影响调整细胞浓度为4×105个/mL，接种到48孔板过夜，加入不同浓度的心脑舒通（终浓度分别为50、10、1、0.1 μg/mL）后，预孵0.5 h，然后加入LPS（终浓度为0.1 μg/mL）刺激，培育24 h后收集细胞上清，Greiss法检测NO浓度。

1.5 心脑舒通单体对小胶质细胞NO产生的影响调整细胞浓度为4×105个/mL，接种到48孔板过夜，加入心脑舒通单体（终浓度10 μmol/L）后，预孵0.5 h，然后加入LPS（终浓度0.1 μg/mL）。培育24 h后收集细胞上清，Greiss法检测NO浓度。

1.6 统计学方法所有实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8检测心脑舒通对小胶质细胞活力的影响结果与空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），心脑舒通（0.1～50 μg/mL）没有细胞毒作用，见表1。

表1 心脑舒通对小胶质细胞活力的影响

2.2 Greiss法检测心脑舒通对小胶质细胞分泌NO的影响结果与LPS模型组相比，阳性对照组能明显抑制NO的释放，心脑舒通对NO的释放没有抑制作用。见表2。

2.3 CCK-8检测心脑舒通单体成分对小胶质细胞活力影响结果与空白对照组相比，伪原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、支脱皂苷元、海柯皂苷元、薯蓣皂苷元、L1化合物没有细胞毒作用，纤细原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、L2化合物、L3化合物、L4化合物有细胞毒作用，见表3。

表2 心脑舒通对小胶质细胞NO的影响

表3 心脑舒通单体成分对小胶质细胞活力的影响

2.4 Greiss法检测心脑舒通单体成分对小胶质细胞分泌NO的影响结果与LPS模型组相比，阳性对照组能明显抑制NO的释放，伪原薯蓣皂苷、支脱皂苷元、薯蓣皂苷元、L1化合物能抑制NO的释放，L2化合物、L3化合物、L4化合物也能抑制NO的产生，但结合2.3，其抑制作用可能是细胞毒性产生的，见表4。

表4 心脑舒通单体成分对小胶质细胞NO的影响

3 讨论

心脑舒通对LPS诱导的小胶质细胞NO的产生无明显抑制作用，在心脑舒通13种单体成分中，伪原薯蓣皂苷、支脱皂苷元、薯蓣皂苷元可以在不影响细胞活力的情况下抑制NO产生。

小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，具有免疫防御和炎症反应[5]。脂多糖能激活休眠的小胶质细胞产生的大多数物质，如NO、活性氧、白介素-1β等，都具有神经毒性，可导致神经元死亡[6]。实验研究表明，不影响细胞活力的前提下，心脑舒通部分单体成分能有效抑制小胶质细胞NO的释放[7-8]。因此，心脑舒通抑制小胶质细胞炎症介质的释放可能是其发挥神经保护作用的机制之一。

[1]景浩然，胡利民，王少峡，等.丹红注射液及其活性组分对脂多糖诱导的小胶质细胞NO分泌的抑制作用[J].现代药物与临床，2013，28(3):285-287.

[2]Giovannini MG,Scali C,Prosperi C,et al.Beta-amyloidinduced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the p38MAPK pathway[J]. Neurobiol Dis，2002，11(2):257-74.

[3]van Rossum D，Hanisch UK.Microglia[J].Metab Brain Dis，2004，19(3):393-411.

[4]张锦.心脑舒通对大鼠急性多梗脑缺血的保护作用及机理研究[D].北京：北京中医药大学，2005.

[5]Li J，Zhang SY,Lu M,et al.Hydroxysafflor yellow A suppresses inflammatory responses of BV2 microglia after oxygen-glucose deprivation[J].Neuroscience Letters，2013, 535：51-56.

[6]景浩然，柴丽娟，郭虹，等.大黄酸对内毒素激活小胶质细胞的影响[J].天津中医药大学学报，2012，31(1):34-35.

[7]陶冶，张允岭，刘超，等.心脑舒通胶囊对急性脑缺血再灌注大鼠皮质单胺类神经递质的影响[J].天津中医药，2008，25（6）：503-505.

[8]蔡静，祁冰，侯丽辉，等.妍婷颗粒对脂多糖诱导小鼠脾细胞产生TNF-α的影响[J].天津中医药,2009,26(2): 142-144.

Effect of Xinnao Shutong and its monomer on Lipopolysaccharides activated microglia cells

LU Guo-yan,YANG Hong-yun,WANG Shao-xia,HU Li-min
（Key Laboratory of Tianjin University of TCM,State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine, Tianjin Key Laboratory of Chinese medicine Pharmacology,Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae,Ministry of Education,Tianjin 300193,China）

[Objective]To study the effects of Xinnao Shutong and its monomer composition on microglia(BV-2)and its mechanism.[Methods]The experiment was divided into control group,lipopolysaccharide(LPS)group,dosing group.The effect of Xinnao Shutong(different dilution multiples of Xinnao Shutong and its monomer composition)on cellular activity and the production of nitric oxide(NO)in microglia cell induced by lipopolysaccharide(LPS).[Results] Xinnao Shutong could not significantly inhibit the microglia in releasing NO induced by LPS.Among the 13 kinds of monomer composition of Xinnao Shutong,Pseudoprotodioscin,Gitogenin,Diosgenin could inhibit NO secretion without affecting the cell vitality.[Conclusion]Some monomer composition of Xinnao Shutong can inhibit the releasing of NO in activated microglia.It may be one of the mechanisms of neural protection.

Xinnao Shutong;NO;inflammatory mediators;microglial cell

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.07

R285.5

A

1673－9043（2014）01－0019-03

2013-09-28）

重大新药创制（2011ZX09201-201）。

卢国彦（1986-），女，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。

胡利民，E-mail:huliminth@126.com。