肉苁蓉酶解提取工艺及抗氧化活性研究

2014-04-12高建德范凌云

中成药 2014年12期

关键词：毛蕊肉苁蓉量瓶

高建德, 刘雄*, 范凌云, 余琰, 马腾

（甘肃中医学院, 甘肃兰州730000）

肉苁蓉酶解提取工艺及抗氧化活性研究

高建德1, 刘雄1*, 范凌云2, 余琰2, 马腾3

（甘肃中医学院, 甘肃兰州730000）

目的研究复合酶提取肉苁蓉的工艺;比较传统水提、醇提与酶解后水提、醇提，正丁醇萃取物抗氧化活性。方法以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作为评价指标，选择酶用量、酶解温度、酶解时间为主要因素，通过正交试验确定复合酶提取肉苁蓉的最佳工艺条件，并在此基础上，比较不同提取方法下提取物抗氧化活性。结果复合酶强化提取肉苁蓉最佳工艺参数为复合酶 0.2%、酶解温度 60 ℃，酶解时间 2.5 h; 等量药材同体积肉苁蓉提取液，抗氧化活性依次为:酶解后醇提＞酶解后水提＞传统醇提＞传统水提。结论在所得的复合酶提取肉苁蓉工艺条件下，肉苁蓉抗氧化活性可以显著提高。

肉苁蓉;复合酶;提取工艺;抗氧化活性

肉苁蓉 Cistanche deserticola YC.Ma是我国传统名贵中药材，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效［1］。当前，评价肉苁蓉质量主要是对《中国药典》规定的指标成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的量进行检定，近代药理学研究也表明，该药材中的松果菊苷和毛蕊花糖苷能提高机体免疫功能，促进 DNA合成，增强体力，提高智能，具有明显的抗衰老作用［2-3］。自由基具有高度的化学反应活性，其过多或清除过慢，都会加速机体衰老，并且会诱发多种疾病［4］。铁氰化钾法总还原力测定、 DPPH·（二苯代苦味酰自由基）分析法被广泛用于抗氧化活性研究，是用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速、简便、灵敏可行的方法［5］。

酶技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术。通过选用一些恰当的酶类，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶等物质降解，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率提高［6］。为了更好地开发利用这一珍贵的资源，本实验在纤维素酶提取肉苁蓉中苯乙醇苷［7］、果胶酶酶解研究基础上，将纤维素酶与果胶酶按一定比例混合制成复合酶，并对复合酶提取肉苁蓉工艺进行优选，在酶解强化提取基础上，将传统水提、醇提及酶解强化水提、醇提进行了抗氧化活性研究，以便为肉苁蓉科学生产合理应用提供理论依据。

1 仪器与试药

肉苁蓉购于甘肃省安宁医药公司，经甘肃中医学院鉴定教研室杨扶德老师鉴定为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥带鳞叶的肉质茎。松果菊苷对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号 111670-200503）;毛蕊花糖苷对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号111530-200303） ;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（纯度＞96%，Sigma公司）; 正丁醇（分析纯）; 甲醇、乙腈、醋酸（色谱纯）;95%乙醇（色谱纯）; 纤维素酶、果胶酶均购于宁夏和氏壁生物技术有限公司。

Waters高效液相色谱仪（美国， 1525 型输液泵， 2487型紫外检测器， 2996 型检测器， 717 自动进样器， waterts Empower色谱软件）;UV1800PC 型紫外分光光度计; FA1604s电子天平;DD-5M型湘液离心机;DZF-6051 型空干燥箱。

2 实验方法

2.1 提取物测定

2.1.1 色谱条件检测波长为 334 nm; 流动相为乙腈-甲醇-1%醋酸（10 ∶15 ∶75），体积流量 1 mL/min，等度洗脱;Agilent HC-C18色谱柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）。

2.1.2 对照品溶液制备精密称取松果菊苷 10.00 mg，毛蕊花糖苷 10.00 mg，用流动相定容至 50 mL，作为对照品贮备液。

2.1.3 供试品溶液制备取 20 g肉苁蓉药材，精密称定，浸泡一定时间，加 8倍量水煎煮 2次，每次 2 h，合并煎液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至 50 mL量瓶中，加流动相至刻度，贮备待用。

2.1.4 线性关系考察分别将松果菊苷、毛蕊花糖苷贮备液移取2mL至10mL量瓶中，用流动相定容，作为对照品使用。分别进样 1、 2、 4、 8、 10、 20 μL，将进样量 X（μg）和峰面积 Y做线形回归。结果松果菊苷标准曲线回归方程为 Y=6.89 ×105X-6.67 ×104， r=0.999 9; 毛蕊花糖苷标准曲线回归方程为 Y=5.74 ×105X-6.69 ×104， r= 0.999 9。表明松果菊苷和毛蕊花糖苷均在 0.2 ～14.0 μg范围内呈良好线性关系。

2.1.5 精密度考察同一供试品溶液，连续进样 5 次，测得松果菊苷峰面积的 RSD为 1.6%，毛蕊花糖苷的 RSD为 1.8%。

2.1.6 重复性试验取同一批供试品溶液，按 “2.1.3”项下方法制备5份溶液，以上述色谱条件测定，松果菊苷峰面积的 RSD 为 1.3%，毛蕊花糖苷峰面积的 RSD为 1.9%。

2.1.7 加样回收率试验取 6 个 25mL量瓶，从用酶解强化水提的肉苁蓉样品液中吸取 1.00、 2.00、 3.00 mL于前3个量瓶中，后3个量瓶中加入同样多的样品液，然后分别精密加入相应的对照品溶液，各份均按上述测定方法进行测定，测得松果菊苷和毛蕊花糖苷的加样回收率分别为98.9%和 97.8%， RSD分别为 1.9%和 1.8%。

2.1.8 样品测定分别称取肉苁蓉药材粉末 20 g，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，测定对照品及供试品，结果见图 1、图 2。

图1 混合对照品色谱图

图2 样品色谱图

2.2 复合酶提取正交试验方案在单因素试验基础上，发现纤维素酶用量在 0.1%，果胶酶用量在 0.15%时对肉苁蓉提取影响较为显著（另文发表），故为简化实验过程，在正交优化试验过程中，按照复合酶（纤维素酶 ∶果胶酶 =2 ∶3）配比，并按表 1 设计选择不同酶用量、酶解时间、酶解温度进行酶解，酶解后水提2次，每次2 h，提取液浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，完全转移至50 mL量瓶中，加流动相至刻度，按正交试验要求共得到 9 份样品液，分别用 0.45 μm微孔滤膜滤过定容至10 mL量瓶，标注为样品液1 ～9 号，测定各样品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的量，计算其提取率。正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平

2.3 提取物的抗氧化活性测定方法

2.3.1 总还原力测定（铁氰化钾法［8］）取试样 2mL，加2.5mL pH 6.6 磷酸缓冲溶液、 2.5 mL 1% 铁氰化钾，混合物在 50 ℃恒温条件下，加热 20 min。急速冷却，加 2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀后以 3 000 r/min 离心 10min。取上层清液 2.5mL，加 2.5mL蒸馏水再加 0.5mL 0.1%FeCl3，混合均匀，静置 10min 后，在 700 nm处测定吸光度。

2.3.2 提取物 DPPH·清除活性测定［5］精密称取 DPPH 4.4mg用 95%乙醇溶解并定容至 100 mL，得 DPPH溶液。取试样 2 mL加 DPPH溶液 2 m L，在室温下反应 30 min 后于 517 nm处测定吸光度（Ai）; 同时测定 DPPH乙醇溶液 2 mL和 95%乙醇 2 mL的吸光度（AO）及各样品液 2 mL分别加 95%乙醇 2 m L的吸光度（Aj）。各吸光度值平行测定3 次，取其平均值。按下式计算 DPPH·清除率。

DPPH·清除率（%） = ［1- （ Ai-Aj） /AO］ ×100

3 不同提取方法抗氧化活性

3.1 酶解强化水提准确称取 20 g肉苁蓉药材，浸泡一定时间，按已优化复合酶酶解工艺酶解，药渣加8倍量水煎煮2次，每次2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至 50 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，再分别移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、6.00、 8.00mL置于 25 mL量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度（换算成生药材质量浓度分别为 0.016、0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/mL）的溶液，按照总还原力测定、 DPPH·方法测定。

3.2 酶解强化醇提准确称取 20 g肉苁蓉药材，浸泡一定时间，按已优选复合酶酶解工艺酶解，药渣加8倍量75%乙醇回流提取 2 次，每次 2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至50 mL量瓶中，加 95%乙醇至刻度，再分别移取上述溶液1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于 25 mL量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度（换算成生药材质量浓度分别为 0.016、 0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/mL）的溶液，按照总还原力测定、 DPPH·方法测定。

3.3 传统水提准确称取 20 g肉苁蓉药材，浸泡一定时间，滤过，药渣加 8倍量水煎煮 2次，每次 2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至 50 mL量瓶中，加 95%乙醇至刻度，再分别移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于25 mL量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度（换算成生药材质量浓度分别为 0.016、 0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/m L）的溶液，按照总还原力测定、DPPH·方法测定。

3.4 传统醇提准确称取 20 g肉苁蓉药材，浸泡一定时间，滤过，药渣加 8 倍量 75%的乙醇回流提取 2 次，每次2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至 50 mL量瓶中，加 95%乙醇至刻度，再分别移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于25 m L量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度（换算成生药材浓度分别为 0.016、 0.032、 0.064、0.096、 0.128 g/mL）的溶液，按照总还原力测定、DPPH·方法测定。

4 结果与分析

4.1 正交试验结果结果见表 2，方差分析见表 3、表 4。

表 2 正交试验结果（n=3）

表3 松果菊苷得率方差分析

表4 毛蕊花糖苷得率方差分析

从表2直观分析可知，各因素对肉苁蓉提取松果菊苷得率和毛蕊花糖苷的影响程度为B＞C＞A，初步认为工艺条件最佳组合为 A3B2C3。方差分析结果表明酶解时间（B）具有显著意义。综合分析，确定最佳提取工艺条件是温度 60 ℃，酶解时间 2.5 h，酶用量为 0.2%。

4.2 抗氧化活性结果由图 3、图 4 可知，肉苁蓉传统水提、醇提物及酶解后水提、醇提物均具有一定的抗氧化活性，但在同一体积，同一批号药材，相同生药材质量浓度下， 4 种不同提取方法以酶解后用 75%乙醇提取铁氰化钾总还原力所表征的吸光度最大，（DPPH·）自由基清除率也最大。铁氰化钾总还原力、（DPPH·）自由基清除率所表现出的顺序为酶解后醇提＞酶解后水提＞醇提＞水提。

5 讨论

图3 铁氰化钾法总还原力测定

图4 提取物 DPPH·清除活性测定

中药有效成分的提取和分离直接关系到其制剂的质量和疗效，随着中药提取领域新技术的不断应用，中药提取技术有了极大飞跃，新技术具有效率高、耗能低等明显优势。作为国家二级保护植物，并收入《国际野生植物保护名录》和濒危动植物种国际贸易公约（CITES）附录二的肉苁蓉［9］，提高其利用率，节约其资源，成为科研工作者研究的热点。孙萍等［10］采用微波提取技术对肉苁蓉中总黄酮和多糖进行了提取研究，结果提取周期缩短，提取效率提高。欧阳杰等［11］采用超声集成技术研究了肉苁蓉中有效成分苯乙醇糖苷类化合物、甜菜碱和肉苁蓉多糖的提取方法。生物酶技术自 20 世纪 90 年代用于中药提取中以来，产生了显著性效益，已在中药生物碱［12］、黄酮［13］、香豆素［14］、多糖［15］、皂苷［15］提取等方面均有报道。但有关肉苁蓉酶解技术的报道甚少，课题组以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作为评价指标，研究了纤维素酶和果胶酶按一定比例混合提取肉苁蓉的最佳条件，并对酶解后醇提、酶解后水提、醇提、水提抗氧化活性作了对比分析，结果表明，肉苁蓉经复合酶辅助单元提取后，可使其中松果菊苷和毛蕊花糖苷提取率明显提高;抗氧化方面表现出的是，酶解后肉苁蓉采用醇提较传统醇提抗氧化能力显著提高，且由曲线中点的变化来看，肉苁蓉提取物的添加量在一定实验范围内与其抗氧化性呈正相关。

［1］刘友刚，王威，徐荣，等.肉苁蓉及其醇提物的傅里叶变换红外光谱研究［J］.中国医院药学杂志， 2010， 30（15）:1257-1260.

［ 2 ］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北京: 中国医药科技出版社， 2005:90.

［ 3 ］张思巨，刘丽，于江泳，等.HPLC同时测定肉苁蓉药材中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中国药学杂志，2004， 39（10）:740-741.

［4］刘德胜，刘琳琳，刘为忠.落地生根总黄酮提取工艺及其清除自由基作用的研究［J］.中成药， 2012， 34（11）: 2236-2239.

［ 5 ］胡喜兰，韩照祥，陶莹，等.DPPH·法测定17 种植物的抗氧化活性［ J］.食品科技， 2006，（10） :264-268.

［ 6 ］余洪波，张晓昱.酶法在中药提取中的研究进展［J］.中成药， 2005， 27（5）:591.

［7］高建德，刘雄，魏舒畅，等.纤维素酶提取肉苁蓉中苯乙醇苷的工艺研究［J］.中药材， 2013， 36（2）:311-313.

［8］吴海虹，玄国东，刘春泉，等.肉苁蓉苯乙醇苷的纯化及其抗氧化活性研究［ J］.食品科学， 2008， 29 （6 ）: 190-193.

［9］陈君，谢彩香，陈士林，等.濒危药材肉苁蓉产地适宜性数值分析［ J］.中国中药杂志， 2007， 32 （ 14 ）: 1396-1401.

［10］孙萍，兰卫，李艳，等.微波提取肉苁蓉中总黄酮和多糖的含量测定［J］.中草药， 2003， 34（6）: 附 1.

［11］欧阳杰，赵兵，王晓东，等.肉苁蓉有效成分提取集成方法的研究［ J］.武汉植物学研究， 2003， 21 （6 ）: 526-530.

［12］于敬，周晶.生物酶解技术在中药提取中的应用［J］.现代药物与临床， 2010， 25（5）:340-344.