陈细清，樊燕，关亚丽

（海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）

植物多倍体（polyploid）是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体[1].多倍体拥有更高的杂合性和更迅速的环境适应力，同普通二倍体相比，植株巨大，抗逆性增强，克服远缘杂交的不育性.

由于天然多倍体发生率低，数量少，难以进行选择，因此，育种实践中常用人工诱导的方法获得多倍体.与传统的诱导方法相比，离体条件下诱导多倍体具有诱变率高，可及时分离嵌合体，培养条件容易控制等优点，因此应用广泛.

1 离体条件下诱导多倍体的优点

1.1 可及时分离嵌合体

嵌合体在多倍体诱导中是普遍存在的问题，应尽早对嵌合体进行分离，减少未加倍的细胞，保证加倍细胞的繁殖[2].应用组织培养技术进行多倍体育种，可以及时分离嵌合体，提高诱导率.离体条件下诱导获得的试管苗生根后，对根尖进行显微鉴定或取叶片用流式细胞仪进行倍性检测，不仅能及时分离嵌合体，而且对幼苗损伤也很小.如A.T.Roy 等诱导获得四倍体蛇麻花（Humulus lupulusL.）过程中对新生的叶片用流式细胞仪进行检测，检测得到四倍体芽后再离体培养，就可培养出单纯的四倍体植株，缩短了育种的时间[3].此外，应用花药离体培养技术，不仅缩短育种年限，还能获得较纯合的多倍体.

1.2 获得优良性状的植物品种

多倍体育种可增大植物的营养器官，增强植物抗逆性，其次生代谢产物含量也往往会发生变化，因此是一种获得有效成分含量高的新品种的有效方法.吴青青等[4]对百合系列间杂种用浓度为0.05%的秋水仙素处理24h得到的多倍体植株与正常植株相比，叶片肥厚，叶面变宽，叶色深绿，气孔显著增大.杭白芷多倍体药用成分欧前胡素含量比原植物高2倍[5].有研究表明，日本薄荷和库叶薄荷诱导的异源四倍体具有抗粉霉病、抗寒等特点[6].

2 影响多倍体诱导率的因素

研究表明，丛生芽[7]、愈伤组织[8]、种子[9-10]、原生质体[11]、体细胞胚胎[12]、叶片[13]、子房[14]等均可作为诱导植物多倍体的材料.选择何种外植体做为诱导材料，对多倍体诱导率的影响很大.离体条件下诱导多倍体时，多选择愈伤组织和组培芽作为诱导材料.张承妹和陆家安[15]的研究表明，黄瓜组织培养时，秋水仙素作用于愈伤组织的胚性细胞能分化出四倍体再生植株.

秋水仙素、吲哚乙酸、除草剂[16]、生物碱等多种物质均可作为诱变剂诱导植物多倍体，其中，秋水仙素因成本较低且可获得较高的诱导效率，已在多种植物中获得成功，是化学诱导多倍体植物使用最为广泛的的诱导剂[17].除草剂在某些植物种中的多倍化程度高、药害轻[18].Dhooghe 等对花毛茛进行离体多倍体诱导，发现2 μmol·L-1氟乐灵处理后多倍体诱变率最高，达27.5%；1 μmol·L-1安磺灵也能得到较高的诱变率[19].

近年来，植物组织培养技术飞速发展，利用化学诱导剂处理离体组织诱导多倍体的技术也日渐成熟.根据处理方式的不同可分为滴液法、浸渍法和混培法等.陈柏君[20]等报导用秋水仙素直接浸泡愈伤组织分化的芽点可以诱导获得黄芩的同源多倍体，诱导率达到15%.寻晓红[21]等用0.05%秋水仙碱溶液浸泡黄花蒿的愈伤组织48h，诱变率达60%.采用在添加秋水仙素的MS 培养基上处理花叶绿萝[22]和丹参[23]的丛生芽分别获得了同源四倍体植株.对大花蕙兰宝石原球茎进行多倍体诱导实验，则发现以混培法效果较好，在秋水仙素3%、处理15d 的条件下，诱导率最高达30%[24].三种方法各有优缺点，在应用时，要根据实际情况选择诱导方式，从而提高诱导率.

不同的诱变剂浓度及处理时间对植物和外植体的作用效果不同.一般来说，高浓度短时间和低浓度长时间的组合可以保证较高的诱导率和存活率.研究表明，300 mg/L 秋水仙素处理离体的金线莲外植体3～19 h 均可使其染色体加倍，而处理13 h 时细胞染色体完全加倍率达到最大，为72.7%[25].对草莓离体叶片诱导多倍体的结果显示，用不同浓度秋水仙素处理均能产生多倍体植株，且多倍体诱导率随秋水仙素浓度先升后降.用体积分数0.3%秋水仙素浸泡处理4 d是最佳的草莓离体叶片诱导方法，多倍体诱导率达到100.0%，并且诱导产生出16X 的植株[26].0.05%秋水仙素处理大蒜6 d 时，其染色体加倍率达到最高，为28.67%.随着浓度的增加和处理时间的延长，植株的死亡率逐渐上升，气孔面积也出现上升趋势[27].

3 多倍体的鉴定

植物材料在离体诱导后，部分不能成功加倍，因此，在诱导后必须及时鉴定，才能准确地筛选出多倍体植株.目前鉴定多倍体主要采用形态学、细胞学鉴定、染色体计数、分子标记等方法.

形态学鉴定是最简单的多倍体鉴定方法.不同倍性植株早期幼苗在根、茎、叶、花器和果实的形态和大小上会有比较明显的差别.陈发棣等诱导的菊花（Dendranthema mankingense）四倍体与二倍体相比，主茎增粗，叶片加厚、加宽[28].郑思乡等诱导出的四倍体三色堇（Viola tricolor）叶色浓绿、叶片肥厚、花大、花瓣厚、香味浓、气孔和花粉粒巨大[29].刘庆忠[30]等发现四倍体皇家旮旯苹果节间缩短，叶片变圆，叶形指数减小.

多倍体叶片表皮中保卫细胞尺寸变大，气孔变大，气孔密度变小，叶绿体变大，数目增多，花粉粒颗粒大小不整齐，败育花粉粒较多，小孢粉母细胞增大，在减数分裂中有异常行为，梢端组织发生层细胞及核较大[31].因此，可根据气孔大小、叶绿体数目及花粉粒大小、形状等特征来鉴定植株倍性.阎志红等采用FDA荧光鉴定法发现四倍体西瓜的保卫细胞叶绿体数目增加，每对保卫细胞的叶绿体数由8 个增加到15个[32].

通过检验分生组织内细胞的染色体数目进行鉴定，是最直接、也是最准确的鉴定方法[33].由于染色体制片技术早已成熟，这种方法已经广泛应用于植物的多倍体鉴定.

流式细胞仪可快速测定细胞核内DNA 含量和细胞核大小，是大范围实验中鉴定植株倍性的快速有效的方法[34].该方法不受植物取材部位和细胞所处的时期限制，省时方便，但测定费用较高.

4 离体条件下诱导多倍体技术在小桐子研究中的应用展望

离体条件下诱导多倍体在植物育种中已有广泛的应用.小桐子（Jatropha curcasL.）为大戟科（Eu⁃phorbiaceae）麻疯树（Jatropha）属落叶灌木或小乔木，我国的海南、云南、广东、广西、四川、贵州、台湾、福建等地都有栽培[35]，是传统的木本油料植物.向家英等[36]对麻疯树籽油作为柴油机燃用油进行了实验，结果表明麻疯树籽油和柴油混溶油的工作性能良好，野生麻疯树籽油含矿物质元素较少，在生产和使用中对环境污染极小.因此，小桐子已成为公认的具有产业化应用前景的能源植物，具有很高的研究和开发价值.但目前，大部分小桐子尚处于野生状态，未被驯化栽培，现有品种良莠不齐，缺乏可大面积推广应用的高产优质品种[37]，因此，培育和筛选出品质优良、极具开发潜力的小桐子品种，已成为迫切需要解决的问题.而采用组织培养和化学诱导相结合的方式，在离体条件下诱导小桐子多倍体，以求获得含油量高、抗性更强的小桐子新品种，可以作为小桐子育种工作的一个研究方向.

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