陈文豪，李玖慧，惠阳，宋小平，陈光英*，韩长日，韩姣姣

（1.海南师范大学化学与化工学院，海南海口571158；2.海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室，海南海口571158）

海南青梅（Vatica mangachapoiBlanco）为龙脑香科（Dipterocarpaceae）青梅属（Vatica）植物，又名青梅，为海南特有植物.在民间，青梅叶长期用作杀菌消毒，治疗肝炎及提取中药龙脑香.国内外学者对青梅属植物进行研究发现，该属植物主要含有白藜芦醇低聚体、三萜类化合物以及异香豆素类化合物.白藜芦醇低聚体由于具有良好的抗HIV[1]、抗肿瘤[2]等活性而备受学者关注.课题组前期实验中发现青梅提取物具有很好的抗氧化[3]、抗HIV[4]和抗肿瘤[5]等生物活性，并从青梅中分离得到三萜类和黄酮类等化合物[6-8]，本实验建立在前期工作基础上，进一步开展青梅化学成分研究，从中分离得到4 个白藜芦醇类化合物（1-4），化合物1为首次从该属植物中分离得到，并对所有化合物进行了体外抗肿瘤活性测试.

1 实验部分

1.1 实验材料、仪器与试剂

青梅茎采自海南省昌江县霸王岭国家森林公园自然保护区，经海南师范大学生命科学学院钟琼芯教授鉴定为龙脑香科青梅属植物青梅（Vatica man⁃gachpoiBlanco），标本现存于海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室.

Bruker AV400MHz超导核磁共振仪（瑞士Bruker公司），Bruker ESQUIRE HCT 质谱仪；洁净工作台(苏净集团安泰公司)；紫外分析暗箱YOKO-ZX（武汉药科新技术开发有限公司）；高压灭菌锅（森展企业有限公司）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；Elx800 型酶标仪（美国BioTek 公司）；MCO-15AC 型CO2恒温培养箱（SANYO 公司）；超净工作台（苏州净化设备厂）；RPMI-1640 培养液（Gibco 公司)；胰酶（Gibco 公司）；MTT（Sigma 公司）；石油醚（60-90℃）、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等（西陇化工股份有限公司，分析纯）.乙醇（70%）为工业级，薄层硅胶GF254 和柱色谱硅胶（100-200目，200-300目，青岛海洋化工厂）；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（Amersham Blosclences 公司）.

1.2 单体化合物的分离纯化

青梅（V.mangachampoi）茎27 Kg 用70%的乙醇室温浸泡三次，7 天/次，合并提取液，60 ℃减压浓缩得棕色干浸膏2100 g.将浸膏混悬于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压回收溶剂，得石油醚部位10 g，氯仿部位103 g，乙酸乙酯部位888 g，正丁醇部位900 g.乙酸乙酯部位（888 g）用100-200 目硅胶拌样，进行硅胶柱色谱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇为溶剂进行洗脱，薄层层析检测合并相似流分得到10 个组分（A～J）.本研究主要从组分6 开展，经反复硅胶柱色谱（CHCl3∶MeOH=5∶1）、sephadex LH-20（CHCl3∶MeOH=1∶1）及制备薄层层析（CHCl3∶MeOH=4∶1）等方法分离纯化，依次得到化合物1（20.2 mg），2（8.4 mg）、3（5.0 mg）和4（15.6 mg）.

1.3 体外肿瘤细胞增殖抑制活性实验

小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）和人肺腺癌细胞（A549）由南京中医药大学提供；本实验室续代培养，细胞在含有10%小牛血清的RPMI-1640 培养基中，于5%CO2、37 ℃温箱中培养.

采用MTT 法[9]测试单体化合物的肿瘤细胞增殖抑制试验：取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，10%新生小牛血清的RPMI-1640 培养液调制成5×104个/mL-1的细胞悬液，接种于96 孔板中，每孔接种180 μL.在37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养8-10 h，待其贴壁，每个孔加入用PBS配制的样品液，使得样品终浓度分别为1，10，和100 μg/mL.每个浓度平行3 孔，继续培养44 h 后，每孔加入50 μL MTT（1 mg/mL-1，PBS 配制），在37 ℃、5% CO2条件下继续温育4 h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型振荡器上摇匀15 min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570 nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组（仅加入含细胞的培养液）和对照组（以培养液替代药物），计算细胞增殖抑制率.抑制率（%）=（1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值）×100%.

2 结果与讨论

2.1 化合物的结构鉴定

化合物1：红色无定形粉末，易溶于丙酮.在碘蒸气中显棕红色，三氯化铁反应呈阳性；ESI-MSm/z361[M+H]+,359[M-H]-；1H-NMR(400 MHz,Acetoned6)δH：7.54 (1H,d,J=1.6Hz,H-5),7.35 (1H,d,J=1.6Hz,H-7),7.54(2H,d,J=8.8Hz,H-2 ′,6 ′),7.11(2H,d,J=8.8Hz,H-3′,5′),6.38(1H,d,J=2.4Hz,H-3″),7.26 (1H,d,J=2.4Hz,H-5″),14.2 (1H,s,H-2″-OH)；13C-NMR(100 MHz,Acetone-d6)δC：158.5(C-2),110.1 (C-3),127.0 (C-3a),136.6 (C-4),109.3 (C-5),155.1(C-6),105.7(C-7),159.4(C-7a),123.5 (C-1 ′),132.6 (C-2 ′,6 ′),117.9 (C-3 ′,5 ′),161.5 (C-4 ′),188.8(C=O),113.2(C-1″),169.4(C-2″),104.2(C-3″),165.7(C-4″),104.7(C-5″),139.3(C-6″).以上数据与文献[10]报道的diptoindonesin G 的波谱数据基本一致.检索发现，仅有三篇文献对该化合物进行报道，其中两篇报道从坡垒属的两种植物中分离得到，同时发现该化合物具有很好的抑制老鼠白血病细胞（P-388）增殖活性[10]和抑制免疫反应的活性[11]，另一研究小组还完成了该化合物的全合成[12].

化合物2：红色无定形粉末，溶于丙酮，微溶甲醇，三氯化铁反应呈阳性；ESI-MSm/z455[M+H]+,453[M-H]-；1H-NMR(400 MHz,Acetone-d6)δH：7.22(2H,d,J=8.0Hz,2a/6a),6.84(2H,d,J=8.0Hz,3a/5a),5.45(1H,d,J=5.2Hz,7a),4.49(1H,d,J=5.2Hz,8a),6.24(3H,brs,10a,12a,14a),7.19(1H,d,J=8.0Hz,2b,6b),6.75(1H,d,J=8.0Hz,3b,5b),6.91(1H,d,J=15.6Hz,7b),6.73(1H,d,J=15.6Hz,8b),6.36(1H,brs,12b),6.73(1H,brs,14b);13C-NMR(100 MHz,Acetoned6)δC：130.0(C-1a),128.6(C-2a,6a),116.2(C-3a,5a),158.1(C-4a),93.8(C-7a),56.9(C-8a),147.3(C-9a),104.1(C-10a),159.7(C-11a,13a),102.2(C-12a),104.1(C-14a),129.7(C-1b),127.9(C-2b,6b),116.1(C-3b,5b),158.1(C-4b),127.8(C-7b),130.0(C-8b),136.2(C-9b),116.1(C-10b),162.2(C-11b),96.7(C-12b),158.1(C-13b),106.9(C-14b).以上数据与文献[13]报道的（+）-ε-viniferin的波谱数据基本一致.

化合物3：黄色不定型粉末，易溶于丙酮.在碘蒸气中显棕红色，三氯化铁反应呈阳性；ESI-MSm/z467[M+H]+,465[M-H]-；1H-NMR(400 MHz,Acetoned6)δH：7.71(2H,d,J=8.8Hz,2a,6a),6.99(2H,d,J=8.8Hz,3a,5a),6.60(1H,brs,12a),6.70(1H,brs,14a),6.85(2H,d,J=8.0Hz,2b,6b),6.58(2H,d,J=8.0Hz,3b,5b),6.15(1H,brs,7b),7.08(1H,brs,12b),7.36(1H,brs,14b)；13C-NMR(100 MHz,Acetone-d6)δC：123.1(C-1a),131.0(C- 2a,6a),116.6(C- 3a,5a),159.5(C- 4a),153.3(C-7a),116.2(C-8a),135.3(C-9a),114.1(C-10a),158.3(C-11a),102.9(C-12a),157.7(C-13a),109.0(C-14a),131.1(C- 1b),128.5(C- 2b,6b),115.7(C- 3b),114.7(C-5b),155.7(C-4b),56.0(C-7b),196.9(C-8b),129.4(C-9b),122.5(C-10b),154.9(C-11b),102.5(C-12b),156.1(C-13b),112.0(C-14b).以上数据与文献[14]报道的hopeahainol的波谱数据基本一致.

化合物4：绿色针状晶体，易溶于甲醇，丙酮，在碘蒸气中显黑色，三氯化铁反应呈阳性；ESI-MSm/z449[M+H]+,447[M-H]-；1H-NMR(400 MHz)δH：7.72(4H,d,J=7.6Hz,2a,2b,6a,6b),7.00(4H,d,J=7.6Hz,3a,3b,5a,5b),7.21(2H,s,10a,10b),6.81(2H,s,12a,12b); 13C-NMR(100 MHz)δC：122.5(C-1a,1b),128.8(C-2a,6a,2b,6b),115.9(C-3a,5a,3b,5b),158.4(C-4a,4b),148.7(C-7a,7b),121.5(C-8a,8b),111.0(C-9a,9b),104.9(C-10a,10b),157.2(C-11a,11b),97.0(C-12a,12b),153.5(C-13a,13b),123.6(C-14a,14b).以上数据与文献[15]报道的hopeahainol C的波谱数据基本一致.

2.2 化合物的抗肿瘤活性测试

以小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）和人肺腺癌细胞（A549）为研究对象，测试化合物（1-4）对其增殖抑制活性.实验结果发现，在测试化合物当中，化合物1对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）和人肺腺癌细胞（A549）的增殖抑制活性最好，IC50值分别为36.1，20.4 μM，化合物3 的IC50值分别为89.4，53.5 μM，化合物2，4对这两株细胞的IC50值均大于100 μM.

3 结论

本研究从海南青梅中分离鉴定了4 个化合物（1-4），均为白藜芦醇类化合物，其中化合物1 为首次从该属植物中分离得到，且化合物1 对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）和人肺腺癌细胞（A549）的显示一定的增殖抑制活性，IC50值分别为36.1,20.4 μM.

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