陈　颖

(中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心,北京 100123)

我国是世界上最大的食用植物油生产、消费国和最大的油脂油料进口国.随着我国人口增长、生活水平提高,我国对食用油的人均需求量和需求总量将继续保持持续刚性增长的趋势.据预测,2020年我国居民人均年植物油消费量为20 kg,消费需求总量将达到2 900万t[1].

随着消费需求的日益多样化、细分化和高档化,植物油市场也变得非常复杂.目前市场上流通的食用油不仅有各种植物油,如大豆油、菜籽油、花生油、葵花油、芝麻油、山茶油、玉米油、橄榄油,还有各种植物调和油.由于植物油价格往往与其种类和营养价值有关,一些不法商家为了追求暴利,以相对廉价植物油冒充或勾兑高端植物油,以降低成本.调和油以其高营养和好风味受到消费者的喜爱,但许多调和油标签上标注的成分和比例却往往与实际不符.植物油的掺假造假不仅扰乱市场秩序、侵犯消费者权益,甚至危害消费者的身体健康.面对频频曝光的植物油安全事件,打击植物油掺假造假现象,保障植物油安全已成为当务之急.针对食用油的掺假鉴别,国内外研究人员展开了大量研究工作.主要包括利用质谱、色谱、光谱等技术通过特有成分或者整体信息对食用油进行区分的理化方法,基于DNA判别的分子生物学方法以及电子鼻、电子舌等智能感官仿生鉴别方法.本文就以上三大类食用油真伪鉴别方法的最新研究进展、适用范围等综述如下.

1　基于理化分析的植物油真伪鉴别方法

植物油的主要成分是甘油三酯,还含有一些微量成分如色素,维生素等.不同植物油在组分种类或含量上有一定差别,利用理化方法分析不同植物油的组成成分,可以对植物油进行区分.

1.1　色谱法

色谱法(chromatography method)是利用不同物质在不同相态的选择性分配,以固定相对流动相中的混合物进行洗脱,混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果.目前常用的色谱技术主要是气相色谱(gas chromatography,GC)与高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC).根据掺假后植物油脂肪酸组成、含量及结构的变化可以鉴别掺伪种类.

Monfreda等[2-3]对橄榄油和葵花籽油混合物进行了GC脂肪酸分析,应用多种模型识别方法对橄榄油的含量进行了辨别,橄榄油在50%左右时的标准偏差为1.51%.李娟等[4]通过气相色谱法定性和定量分析了5种植物油脂,将每个油脂的9种脂肪酸含量作为变量,进行判别分析建立判别函数,研究表明此函数能够较好地判别植物油脂.也有学者采用高温气质色谱(high-temperature gas chromatography-mass spectrometry,HTGC-MS)分析掺入其他植物油的橄榄油样品的甘油三酯组成,然后使用如簇类软独立模式识别(soft independent modeling of class analogy,SIMCA)的化学计量学方法建立掺伪识别模型,并用遗传算法作为变量选择方法对模型进行优化,能够识别掺杂10%以上其他植物油脂的橄榄油[5-6].

魏明等[7]利用GC研究了芝麻油、菜籽油、低价酸菜油、棕榈油、棉籽油、橄榄油、花生油、葵花油、大豆油和玉米油中分别掺有其他任意一种油后各脂肪酸含量的变化情况,为市售样品检测提供了参考.除了根据脂肪酸组成进行植物油中掺假鉴别外,也有报道根据其他特殊成分对食用油质量进行初步分析.Chen等[8]利用反相高效液相色谱(reversedphase high-performance liquid chromatography,RPHPLC)/荧光检测器,对初榨橄榄油、葵花油、榛子油、大豆油、玉米油、花生油以及杏仁油中的α-、β-、γ-、δ-生育酚进行测定,可以用于初榨橄榄油真实性的初步评价.Blanch等[9]针对难以区分的榛子油和橄榄油,采用GC和反相液相色谱(reversed-phase liquid chromatography,RPLC)对食用油中的榛子酮(filbertone)进行检测,从而将橄榄油和榛子油区分开来.

1.2　质谱法

质谱法(mass spectrometry,MS)的基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离,生成各种不同荷质比的带电荷的离子,经加速电场作用形成离子束,进入质量分析器.在质量分析器中,再利用电场与磁场使发生相反的速度色散,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量.目前常用质谱仪主要有GC-MS、LC-MS、基质辅助激光解析飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionisation timeof-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)和傅立叶变换质谱(Fourier-transform mass spectrometry,FTMS).

Spangenberg等[10]采用气相色谱同位素比值质谱(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry,GC/C/IRMS)研究了橄榄油、南瓜子油、葵花油、玉米油、菜籽油、大豆油和芝麻油中脂肪酸的 C含量,并认为可根据可通过 δ13C16:0与δ13C18:1的变化来鉴别掺假食用油.也有研究人员利用GC/C/IRMS研究亚麻籽油的脂肪酸成分以及每种脂肪酸中稳定C同位素13C/12C的比例.研究发现,采用δ13C18:2n6和 δ13C18:3n3的比值可以鉴别亚麻籽是否掺假,在亚麻籽产地溯源中也具有潜在应用前景[11].Vaclavik等[12]通过对橄榄油中的甘油三酯和某些极性化合物的常压敞开式离子源质谱(ambient mass spectrometry,AMS)结合飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometer,TOFMS)分析,可以鉴别特级初榨橄榄油(extra virgin olive oil,EVOO),橄榄果渣油(olive pomace oil,OPO)、橄榄油(olive oil,OO)以及掺杂了榛子油的橄榄油.并且通过对极性化合物和甘油酸酯的检测还可分别判别出掺假φ=6%和15%榛子油.Catharino等[13]用电喷雾离子质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)鉴别橄榄油、大豆油、玉米油、葵花油、菜籽油和棉籽油,利用在阳离子模式下得到的质谱指纹图谱,能将6种油分成不同的组,而在阴离子模式下能将橄榄油与其他5种油很好的区分.Law等[14]采用萃取电喷雾离子质谱(extractive electrospray ionization mass spectrometry,EESI-MS)建立了特级初榨橄榄油的极性物质及挥发性物质指纹图谱,可用于鉴别特级初榨橄榄油和其他食用油.

1.3　光谱法

光谱法(spectroscopy)是一种“指纹识别”技术,主要是分析食用油中化学基团的总特征光谱,然后结合化学计量学进行数据处理以达到识别的目的.按照检测时所用波谱范围,主要可分成近红外光谱(near infrared,NIR)、中红外光谱(middle infrared,MIR)以及拉曼光谱(Raman).

吴静珠等[15]应用近红外光谱分析技术分别建立了快速鉴别食用植物油种类的定性分析模型以及测定食用植物油主要脂肪酸含量的定量分析模型.实验根据19份食用植物油样品的近红外光谱,结合系统聚类方法建立了纯橄榄-芝麻-花生油定性识别模型,识别率和预测率可达100%.张菊华等[16]采用偏最小二乘法(PLS)建立了油茶籽油中掺杂菜籽油和大豆油的近红外光谱定量检测模型.应用建立的模型对未知样品进行预测,并对预测值和真实值进行比较,在掺杂油含量为2.5% ～100%之间范围内准确可靠.杨佳等[17]应用傅里叶变换近红外光谱(Fourier translation infrared spectroscopy,FTNIR)结合主成分分析-簇类软独立模式识别(principal component analysis-soft independent modeling of class analogy,PCA-SIMCA)和偏最小二乘法-人工神经网络(partial least squares artificial neural network,PLS-ANN),建立了芝麻油、大豆油、花生油、葵花籽油的分类模型.Christy等[18]将近红外光谱和化学计量学有效结合起来用于橄榄油中大豆油、葵花籽油、玉米油、核桃油和榛子油等掺假物的定性、定量鉴别.建立了525种掺假混合油12 000～4 000 cm-1波谱扫描数据的定性定量分析模型,通过主成分(principal component analysis,PCA)和最小二乘定量分析,对上述掺假油的鉴别误差限均低于2%(质量分数).

Rohman等[19]建立了基于傅里叶变换近红外光谱结合化学计量学的特级除榨橄榄油掺入油菜籽油的鉴别方法.也有学者采用傅立叶变换拉曼光谱(Fourier translation Raman,FT-Raman)和傅里叶变换近红外光谱 (Fourier translation middle infrared spectroscopy,FT-MIR spectroscopy)来测定橄榄油中榛子油的含量,通过对油品及其皂化物质的光谱分析表明:该方法可用于橄榄油和榛子油的鉴别,对于橄榄油中榛子油的掺杂量的最低检测量大于8%[20].吴静珠等[21]采用拉曼光谱结合偏最小二乘-线性判别分析(partial least squares-linear discriminate analysis,PLS-LDA)方法,以食用油中橄榄油,花生油和玉米油三个品种为例,建立了单一种类的食用油的识别模型,总体识别率均大于90%.黄秀丽等[22]测定了8种植物油脂的同步荧光光谱和三维荧光光谱.结果表明:在同步荧光光谱图上,不同的植物油品种的特征吸收峰在出峰数目、出峰位置和强度上均有一定的差异;而三维荧光光谱具有“指纹性”,为植物油的鉴别和质量控制提供一种新型的参考方法.

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)与紫外光谱、红外光谱和质谱一起被称为“四大名谱”.由于具有磁矩的原子核在高强度磁场作用下,可吸收适宜频率的电磁辐射,而不同分子中原子核的化学环境不同,将会有不同的共振频率,产生不同的共振谱,记录这种波谱即可判断该原子在分子中所处的位置及相对数目,用于进行定量分析及结构分析.国外有研究人员利用高梯度漫射NMR技术来区分橄榄油和其他油.通过测定掺假橄榄油的漫射系数(diffusion coefficient)变化值,可以检测到掺有10%的葵花油和大豆油以及掺有30%榛子油和花生油的橄榄油,同时利用判别分析还可以对掺假油进行准确的定性和定量预测[23].Vigli等[24]结合1H NMR and31P NMR光谱对13种植物油的192种样品进行区分,通过建立有效的识别/预测模型,结合判别分析可以检测ω为5%的掺假量.

利用光谱技术对植物进行区分,不需要复杂前处理,操作简单迅速.但必须建立有效的数据库,并结合化学计量学对数据进行统计分析才能用于实际样品的定性或定量识别.

2　基于分子生物学的植物油种类鉴别方法

植物油是由不同油料通过物理压榨或化学浸提工艺制成,在加工工艺中,使得植物组织破碎和细胞破裂,所以植物油中会不同程度残留一定的DNA.由于DNA具有种间差异性以及种内保守性,因此可以通过对特异性DNA片段的鉴别进行物种识别.但同时植物油属于深加工产品,特别是精炼植物油,它是在植物原油基础上经过滤、脱胶、脱酸、脱色、脱臭等加工工艺的深加工产品,其中的核酸降解严重,含量极低,且伴随核酸同时存在蛋白质、磷脂、淀粉等多种干扰物质.所以从植物油中提取出较高质量的DNA是利用分子生物学手段进行食用油鉴伪的关键点.

2.1　食用油中DNA提取技术

近年来国内外研究人员在植物油DNA提取方面开展了大量研究工作,取得了一定进展.1998年,Pauli等[25]首次利用试剂盒方法从初榨大豆油中提取出 DNA.Muzzalupo等[26]利用试剂盒 QIAamp DNA Stool从初榨橄榄油中提取出DNA,并且证明提取出的DNA可用于SSR(single sequence repeats)分析.陆续有研究人员证明橄榄油中提取出的DNA还可用其他分子生物学分析[27-28].由于市售样品一般为精炼油,经过脱胶、脱色、除臭等一系列处理,使DNA的提取变得更加困难.有研究人员对大豆油在精炼过程中DNA的变化进行了研究.通过对不同精炼阶段的大豆油进行DNA提取及PCR扩增,发现脱胶是导致大豆油中DNA减少的关键步骤,脱胶使大多数DNA转移到水相中,从而油使相中的DNA大大减少[29].但Hellebrand等[30]却从精炼菜籽油中成功提取出DNA,并用于PCR扩增.针对精炼植物油中DNA的有效提取,Costa等[31]同时采用 Wizard、CTAB以及试剂盒 WizardⓇMagnetic DNA purification system和 NucleospinⓇ提取精炼大豆油中的DNA,通过对大豆内源基因lectin的扩增发现,只有NucleospinⓇ提取出的DNA扩出了目的条带.白立群等[32]采用冷冻干燥法能够有效地从精炼大豆油中提取出DNA.但植物油中的DNA非常不稳定,随着储藏时间的延长容易发生更严重的降解.Pafundo等[33]利用AFLP的方法研究了储藏时间对橄榄油中DNA的影响,结果表明橄榄油DNA的提取最好在压榨后一个月内进行,否则大量DNA降解后会影响到实验的可靠性.

2.2　PCR 技术

PCR(polymerase chain reaction)是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增.PCR可以对物种的特异基因进行有效扩增,从而达到物种鉴别的目的.在常规PCR体系中加入一条标记了荧光基团的探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的方法称之为实时荧光PCR方法,它不仅可以进行定性分析,还可以通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析.目前,实时荧光PCR大量应用在食品中转基因成分检测[34-35]、食品中动物种类鉴别[36-37]以及过敏原检测[38-39]等方面.在食用油种类鉴别上也有相关报道.Zhang等[40]针对油棕榈的特异基因MT3-B设计了引物和探针,同时用普通PCR和实时荧光PCR进行扩增,可以检测到5个拷贝的棕榈DNA.Vietina等[41]等采用高溶解曲线实时荧光PCR建立了榛子油、玉米油、葵花籽油、花生油、芝麻油、大豆油、米糠油和南瓜油的鉴别方法.

2.3　分子标记技术

DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段.分子标记的主要类型有AFLP(amplified fragment length polymorphism),RAPD(random amplified polymorphic DNA),SSR(simple sequence repeat),SCAR(sequence characterized amplified regions),RFLP(fragment length polymorphism),SSCP(single-strand conformation polymorphism)等,除RFLP外,其他分子标记技术都需要借助PCR技术.在植物油种类鉴别中,目前主要用于橄榄油品种溯源[42-43].Wu等[44-45]针对植物的叶绿体基因设计两对通用引物,利用PCR-CE-SSCP技术来区分不同种类的植物油,从而识别橄榄油中掺入的其他植物油.有学者采用基因条码技术,对特定区域DN片段扩增产物进行测序,进而通过寻找SNP(single nucleotide polymorphism)位点,达到对橄榄油中掺假油品鉴定的目的[46-47].

每种DNA markers都有其优缺点,RAPD重复性差;AFLP适合于评价不同品系之间的差异,但不适合混合油的检测;SSR用得最多,能用于高通量的基因分型平台,在对食用油进行分析时应该选择合适的SSR位点以及长度;SSCP对一个碱基差也能区分开,可以分析降解的DNA,但往往需要测序进行验证.由于植物油中是大小不一的DNA片段,合适的DNA marker必须能保证一定的区分力、油料和油的一致性、结果的重复性以及分析的简便性.否则会影响到结果的准确性.

2.4　生物芯片技术

生物芯片技术(biochip)是指将大量生物大分子如核酸、蛋白、多肽甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过杂交信号的强度判断样品中靶分子的数量.

根据固定的探针的种类,生物芯片可分为:基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片;按照检测载体又可分为固相芯片和液相芯片.传统固相芯片技术需要特定的仪器设备对杂交信号进行检测,可视芯片作为一种新型的固相芯片技术,可以将杂交信号在酶的催化作用下沉积在芯片表面,通过芯片厚度的变化而改变芯片颜色从而实现对检测结果的判定.由于该方法不需要特殊的仪器设备,方便快捷,结果肉眼可见,具有很好的应用前景.目前已有学者将该技术用于食源性致病菌、食品中转基因成分和过敏原的检测[48-50].2011年Bai等[51]建立了8种油料作物的可视芯片鉴别方法,为今后准确鉴别8种植物油提供了思路.

液相芯片技术也称为微球体悬浮芯片(suspension array,liquid chip)是一种芯片技术与流式细胞术相结合的技术.该技术将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针,在液相中与标记有荧光报告分子的待测物杂交,当微球探针与目标物结合时,借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物,从而达到对目标物的检测.目前该技术主要用于SNP基因分型[52]、病原体检测[53]、细胞因子检测[54]和基因表达[55]等方面.我们首次将液相芯片技术应用到植物油种类鉴别上,建立了橄榄、花生、葵花、芝麻、菜籽、玉米、山茶、大豆和棕榈等9种油料的液相芯片鉴别方法,对相应食用油的验证结果表明,该方法能准确鉴别调和油中的不同品种并能识别掺假植物油[56-57].

3　基于智能感官仿生技术的植物油种类鉴别的方法

智能感官仿生技术是利用现代信息技术和传感技术模仿人或动物的视觉、听觉、味觉和嗅觉等感觉行为,获取被检测对象品质特性的信息,并模拟人对信息的理解和判别对所获取的信息进行处理的技术.主要包括电子鼻、电子舌等技术.

电子鼻是20世纪90年代诞生的一种人工嗅觉技术(也称传感器阵列技术),利用气敏传感器阵列测定样品中所有挥发性成分的整体综合信息,再用化学计量学的统计学方法,进行定性定量分析.由于不同食用油的挥发性成分种类及含量都有一定差异,通过电子鼻对其所有挥发性成分的测定,即可得到每种食用油的气味指纹图谱,从而达到迅速区分的目的.

国内有多个学者采用电子鼻方法区分芝麻油与其他植物油[58-59],也有学者用该方法检测芝麻油中掺入的芝麻油香精[60].国外有研究人员将超速气相色谱分析fast/GC与SAW(声表面波)传感器电子鼻联用,可以得到形如GC的色谱图,每个峰对应一种具体风味物质.根据保留时间和峰面积,也可以将香气的化学色谱转化成高分辨率的可视化嗅觉图像(VaporPrintTM),从而达到对不同食用油的鉴别[61-62].除了传感器型和色谱型电子鼻外,近年也研发出了质谱型电子鼻.Mildner-Szkudlarz等[63]将传感型电子鼻和质谱型电子鼻的检测结果与SPMEGC/MS进行比较,发现三者对橄榄油和掺杂了菜籽油和葵花油的橄榄油能很好区分.结合模式识别技术,电子鼻不仅可以定性区分植物油,还可以作定量的预测.Lerma-García等[64]将橄榄油按不同比例加入到精炼葵花油中,利用基于多元线性回归的神经网络对各种橄榄油的百分比进行预测,实际值与预测值之间的回归系数均高于0.988,证明人工神经网络能够对未知样进行准确的定量预测.

4　展 望

目前用于植物油种类鉴别的方法主要是理化方法和分子生物学方法.色谱法和质谱法主要通过分析不同植物油中的脂肪酸、植物甾醇、甘油三酯等的种类及含量来区分各种植物油.光谱法和智能感官仿生技术无需对样品进行复杂前处理,操作简单,分析速度快,可以实现样品的无损检测.但由于食品中所含化学成分易受品种、产地、种植环境、采收时间、加工条件以及贮运方式等因素的影响,进而会直接影响到上述检测方法的可靠性.此外,对于一些组成成分比较相近,特别是对存在大量同分异构体化合物的植物油往往也不能很好的区分.而且影响理化或仪器鉴伪技术取样代表性的因素非常多,要保证其方法的可靠性,需要大量的检测样本,建立有效的数据库和科学的模型分析技术.

基于DNA的分子生物学技术能迅速、准确、灵敏的鉴别不同物种,为食品中物种成分的真伪鉴别提供了可靠地依据,在一定程度上弥补了理化方法进行食用油种类鉴别的不足,正成为国际上倍受关注的研究方向.但同时又面临着精炼植物油中DNA提取的难题.虽然大量研究表明,无论是初榨还是精炼的植物油其中都存在可用分子生物学手段进行研究的DNA.但由于不同食用油的加工工艺不同,需要采取不同的DNA提取方法.在对DNA进行分析时,目的片段的选择也非常重要.食用油中的DNA降解程度高,太长的目的片段可能导致PCR扩增失败,而太短又会影响到结果的特异性,且容易导致污染.随着二代测序技术、数字PCR等新型分子检测别技术的开发,分子生物学技术在食用油品种高通量、精准鉴别及定量检测将会有新的突破,也会使其具有更加广阔的应用前景.

综上,考虑到植物油掺假情况的复杂性以及各种方法的局限性,在食用油掺假检测中,应针对具体情况选择适合的方法才能达到食用油的有效鉴别.