陈爱平,郑恩惠,李曲文,徐海滨,杨劲松,王灵岚,郑金凤,严延生

福建省自1962年发生由埃尔托型霍乱弧菌(EVC)引起的霍乱疫情，至今已50年；期间疫情起伏不定，先后发生了几次较大流行；在福建省50年的霍乱流行过程中病原和流行特征都发生着改变[1]。近年研究表明非典型埃尔托菌株(atypical El Tor strains)在东非、亚洲以及海地等地出现，主要特征表现为在埃尔托型基因组中杂合有部分古典型的相关基因ctxB-Cl、rstR-Cl、tcpA-Cl等；陆续发现了Matlab变种(1991-1994年)、Mozambique变种(2004年)、突变埃尔托型(2002年)以及杂交埃尔托型(1991-2004年)等引起的局部流行，此类菌株的出现增加了霍乱流行的复杂性[2]。本文通过PCR扩增相关的毒力基因及对部分菌株的ctxB和rstR基因的序列进行测定和比对，对1962-2005年福建省代表性霍乱菌株进行非典型EVC的研究。

1 材料与方法

1.1实验用菌株 选择1962-2005年福建省历次霍乱流行分离保存的病人和带菌者菌株，均经过血清学重新复核鉴定为O1群霍乱弧菌。包括福建历史上3次霍乱流行的菌株(1962-1964年、1978-1989年、1994-2000年)，以及2005年疫情菌株。

1.2引物 引物序列及相应的扩增条件和参考文献见表1，寡核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 实验用基因及其引物序列

*Cl表示古典型等位基因，El表示埃尔托型等位基因

备注：tcpA-El和tcpA-Cl基因的区别主要位于该基因开放读码框(ORF)的3′端，因此下游引物决定了扩增产物特异性。本文参考使用的tcpA-El基因的下游引物特异碱基位点较多(引物标红部分)，且 3′端的5个碱基是特异的，所以扩增产物的特异性较好；相反tcpA-Cl基因的特异碱基位点较少且处于引物的中间位置(引物标红部分)，而决定PCR扩增特异性的3′端有9个碱基(引物标绿部分)是和埃尔托型共有的序列。原先实验发现部分菌株tcpA-Cl/EL基因PCR扩增同时阳性，而国内外的研究发现霍乱菌株只携带一种tcpA基因；因此对此类部分菌株进行tcpA-Cl/El基因的序列测定比较(古典型序列参考菌株为395,埃尔托型序列参考菌株为N16961)，结果tcpA-El基因的序列是正确的，而tcpA-Cl的序列却显示为tcpA-El的基因序列。因此基因的PCR扩增结果必要时要结合序列测定进行分析。

1.3PCR反应条件 PCR反应均采用20 μL的反应体系，各组成成分的终浓度分别为：Ex Taq DNA聚合酶 0.5 U， dNTP 200 μmol/L，上游引物0.4 μmol/L，下游引物0.4 μmol/L，DNA模板2 μL。

1.4模板的制备 分纯的细菌菌落，直接刮取适量于300 μL的纯水制备成菌悬液，100 ℃煮沸裂解10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清做为PCR检测的DNA模板。

1.5试剂仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司，琼脂糖为BioAsia分装品，BIO-RAD公司的Basic电泳仪，读胶仪为BIO-RAD公司的Gel Doc XR+，PCR扩增仪为G-Storm(英国GeneTech公司)。

1.5DNA序列的测定及比较 序列测定由上海生工完成。由于ctxB(El/Cl)和rstR(El/Cl)基因对于区分霍乱菌株的丝状噬菌体CTXΦ基因组类型有较大意义[2]，为了进一步确认扩增基因型的准确性，挑选部分菌株ctxB(El/Cl)和rstR(El/Cl)基因的PCR产物直接进行双向测序，序列用DNAStar分析软件进行拼接，校正后的序列在NCBI网站上进行核苷酸的Blast比较；同时运用DNAStar分析软件进行序列的MegAlign。

2 结 果

2.169株O1群EVC各毒力基因检测结果 69株1962-2005年从病人中分离到的O1群霍乱弧菌(稻叶21、小川48)，采用PCR扩增技术检测毒力基因,包括ctxA、ctxB(El/Cl)、rstR(El/Cl)、tcpA(El/Cl)、hlyA(El/Cl)。结果69株O1群霍乱弧菌ctxA基因阳性62株(89.9%),7株ctxA基因阴性的菌株均不同程度地携带有其它各相关毒力基因；各毒力因子的阳检率分别为ctxB-Cl60.9%、ctxB-El72.5%,rstR-Cl37.7%、rstR-El72.5 %,tcpA-Cl4.35%、tcpA-El69.6%,hlyA-Cl65.2%、hlyA-El79.7%；各毒力因子埃尔托型基因片段的检出率均要高于古典型；100%实验菌株均不同程度地携带有不同毒力因子的古典型(Cl)及埃尔托型(El)相关基因。详见表2和表3。

续表

序号No.年代Year血清型SerotypectxActxB-CLctxB-ElrstR-CLrstR-EltcpA-CLtcpA-ElhlyA-CLhlyA-El391995小川型+++++-+++401995小川型---++-+--411995小川型+++++-+++421996小川型+++++-+-+431998小川型++-+-----441998小川型++-+--+++451998小川型++-+--+++461998小川型++++---++471998小川型++-+-----481999小川型-------++491999小川型++-++-+++501999小川型++-++-+++511999小川型+++++-+++521999小川型++-++----531999小川型+++++-+++541999小川型+++++--++551999小川型---+-----562000小川型--------+572000小川型-------++582000小川型+-++--+++592000小川型++-++-+--602000小川型+++++-+++612000小川型++-++-+++622000小川型---+-+---632000稻叶型 --------+642005稻叶型 +++---+-+652005稻叶型 +++---+++662005稻叶型 +++-+-+++672005稻叶型 +++-+-+++682005稻叶型 ++--+-+++692005稻叶型 ++----+-+

Note:小川型——Eltor Ogaea;稻叶型——lnaba.

表3 69株O1群EVC各毒力基因检测结果(%)

2.2福建省历次霍乱流行各毒力基因的检测结果 按照福建省1962年以来霍乱先后发生过3次较大流行的时间，将69株实验菌株划分为第1次流行(1962-1964年)、第2次流行(1978-1986年)、第3次流行(1994-2000年)和2005年疫情菌株[1]； 各毒力因子在不同流行时期菌株中的阳检情况见图1。rstR-Cl只在1994-2000年流行的菌株中检出，检出率86.7%(26/30)。

2.3部分菌株序列测定结果 部份菌株ctxB(El/Cl)和rstR(El/Cl)基因核苷酸序列Blast以及MegAlign比对结果，显示为相应基因的古典型或者埃尔托型基因片段。另外，通过ctxB基因序列比对，发现新的204位碱基突变位点(T→G)以及国内外未曾报道过新的ctxB基因型别，命名ctxB基因型10和11。200098菌株同时携带有两种新的ctxB基因型。ctxB基因型10的115位碱基为C(His)，203位碱基为C(Thr)，204位碱基为G(Thr)；ctxB基因型11的115位碱基为C(His)，203碱基为T(Met)，204位碱基为G (Met)。到目前为止报道的ctxB基因型和特异位点(相对应位置的氨基酸)比较，见表4。

表4 霍乱弧菌ctxB基因型别的比较

本文注：*ctxB基因型10在菌株94027和200098的ctxB-Cl基因PCR扩增产物的序列中发现;ctxB基因型11在菌株200098的ctxB-El基因PCR扩增产物的序列中发现。

图1福建省历次霍乱流行各毒力基因的阳检情况

Fig.1DetectionofvirulencegenesinV.choleraeisolatesfromepidemicwavesinFujian

3 讨 论

霍乱肠毒素是产生霍乱的主要的毒力因子，其编码基因ctxAB位于溶原性丝状噬菌体CTXΦ基因组上。传统实验根据rstR基因的开放阅读框以及两侧序列的不同，可以将CTXΦ前噬菌体基因组分为不同的类型,包括古典型CTXΦclass、埃尔托型CTXΦET、加尔各答型CTXΦcalc等不同的基因组类型[12-14]；ctxB基因的特征也做为区分 CTXΦ基因组类型的代表性标志[2]。检测福建省1962-2005年O1群霍乱菌株ctxB、rstR等基因，发现实验菌株均不同程度地同时携带有不同毒力因子的古典型和埃尔托型等位基因，即菌株基因组杂合了古典型和埃尔托型基因片段，这种现象较为常见。历年菌株的表型观察结果显示，1962年以来福建省O1群霍乱弧菌(VC)的第IV组霍乱噬菌体(106/mL)裂解试验、多粘菌素B敏感试验、鸡血球凝集试验和VP试验均符合埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的诊断结果(溶血试验1962-1963年为阳性，1978年开始由阳性转换为阴性)；同时本研究实验菌株各毒力因子埃尔托型等位基因的检出率均要高于古典型；结合以上结果，我们认为福建省的霍乱菌株是在埃尔托型的结构基因基础上杂合了古典型的基因片段，即文献中称为的非典型埃尔托型霍乱弧菌[2]。对福建省不产毒的O1群VC的病人株和外环境株进行研究，也发现此类杂合型的菌株较为广泛存在[15]。

通常，菌细胞内的噬菌体基因组会对同类型噬菌体的超感染具有免疫作用，霍乱溶原性丝状噬菌体CTXΦ免疫性是由rstR基因介导的[16]。实验表明所检测霍乱菌株的rstR-El基因的检出率比rstR-Cl基因要高，分别为72.5%和37.7%；由此推断福建省O1群的霍乱弧菌大部分携带埃尔托型CTXΦ前噬菌体，由于菌株对古典型的CTXΦ噬菌体缺乏免疫性，造成古典型CTXΦ基因组成份较为频繁地在菌株上插入或者丢失，可能是产生非典型EVC菌株的重要原因。本研究同时发现有部分表现为ctxA(+)、rstR-Cl(-)、rstR-El(-)的菌株，分布年代分别为1978、1979和2005年，推测这类菌株可能包含有未发现的新CTXΦ基因组类型。我们将进一步分析这类菌株的rstR基因序列。

福建省1962年的霍乱菌株在基因水平就表现为非典型EVC菌株特征；是迄今为止报道出现非典型EVC菌株最早的年代；此前报道出现非典型EVC最早的年代是美国Gulf Coast 埃尔托型菌株[2]。另外，福建省于1994年以后出现整合有rstR-Cl的非典型EVC菌株；值得注意的是，福建省rstR-Cl基因出现的年代同国际上报道的大部分非典型EVC菌株出现的时间相近[2]；需要进一步研究rstR-Cl基因出现在福建省霍乱菌株的意义。同时，根据已知的霍乱弧菌遗传特征，古典型菌株与埃尔托菌株不仅存在上述单基因的差异，其它基因簇如VSP-I、VSP-II和RTX基因簇(rtxA-rtxD)等[17]，也有助于区分两种生物型。因此，结合这些基因进行分析，能够全面揭示福建省这类非典型埃尔托型霍乱菌株的分子特征。

在霍乱弧菌的不同血清型和生物型中存在ctxB特异碱基位点的差异[2],已发现的ctxB基因型别见表4。本文根据部分菌株的ctxB基因序列测定结果，发现国内外未曾报道的ctxB基因型别(10和11)，两种基因型别均存在204位碱基的位点突变(T→G)。菌株200098同时存在两种新的ctxB基因型别,说明在同一菌株中存在不同的ctxB基因型别杂合形式。ctxB基因型11的115位碱基为C，表现为古典型ctxB位点特征，203位碱基为T，表现为埃尔托型ctxB位点特征，提示在ctxB序列上存在不同生物型别的特异位点组合形式;到目前为止只在O139群的ctxB基因型别4和型别6中存在类似的情况(见表4)。结果表明福建省O1群霍乱弧菌在ctxB基因型别上表现出独特的地方分子特征。我们将选择更多的霍乱菌株，进一步对ctxB基因进行序列测定，并与不同国家、地区及年代菌株的相关序列进行综合比较，分析不同的ctxB基因型对于这类菌株在福建省霍乱流行过程及病原演变中的意义。

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