王思农 张 博柳文红 杨鹏斐

生肌白玉膏对大鼠深II度烫伤创面EGF和VEGF表达的影响

王思农 张 博∗柳文红 杨鹏斐

目的: 评价生肌白玉膏对大鼠深II度烫伤创面肉芽组织中表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法: 80只深II度烫伤大鼠随机分为生肌白玉膏组、美宝湿润烧伤组，生理盐水组和空白组，在第3、7、14、21天用免疫组化方法测定创面肉芽组织中EGF、VEGF阳性细胞变化。结果: 实验组大鼠创面肉芽组织中EGF和VEGF阳性表达明显高于其他组(P＜0.01)。结论:生肌白玉膏可能通过影响EGF和VEGF促进创面愈合。

生肌白玉膏； 创面； EGF； VEGF

生肌白玉膏为甘肃中医学院附属医院院内制剂，主要作用是化腐生肌、消肿止痛、和血止血；主治烫(烧)伤、痈疽疮毒和皮肤溃疡久不收口等外科疾患。本实验采用免疫组化方法测定各组创面肉芽组织中EGF、VEGF的表达，进一步明确生肌白玉膏促进大鼠深II度烫伤创面愈合的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体重180±20 g，由甘肃中医学院SPF实验中心提供(实验动物质量合格证许可证号:SCXK(甘)2011－0001，动物实验设施使用证编号:SCXK(甘)2011－0001－0001333))。生肌白玉膏(甘肃中医学院附属医院批号:20091020)，美宝湿润烧伤膏(汕头市美宝制药有限公司，批准文号:国药准字Z20000004，专利号:ZL 93100276.1；ZL 95116651.4)，生理盐水(四川科伦药业有限公司，2012.7.14，批号:N12071307－2 250 ml:2.25 mg)。实验仪器:BI－2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)，MiE图像处理系统(山东易创电子有限公司)，OLYMPUS显微镜(日本，型号CX21型)。小鼠SP检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司批号:12127A11)，兔SP检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司批号:12122A11)，VEGF抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司批号: ZS－72690 lot:K2311)，EGF抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司批号:BS3549 lot NO:G22121)，阳离子防脱片(北京中杉金桥生物技术有限公司批号:ZLI－9506)，DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司批号:K1266071)。

1.2 方法

1.2.1 造模1造模前大鼠禁食12 h，自由饮水1天，用脱毛膏在大鼠背部脱毛，面积约3 cm×3 cm，清水洗净，擦干。除空白组外，其余3组以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，其背部浸入直径3 cm，温度95℃的烧瓶中约10 s，造成大鼠深II度烫伤(经病理证实)。烫伤后3组均以林格氏液30 mL/kg腹腔注射，抗休克治疗。

1.2.2 分组及给药 造模成功后，将80只大鼠按照随机数字表进行分组，空白组8只，实验组、对照组及模型组各24只，分别涂抹生肌白玉膏1 g、美宝湿润烧伤膏1 g及生理盐水。每日1次，连续给药至处死前1天，共3周。空白组不予任何处理，正常饲养。

1.2.3 取材 分别于造模后3、7、14、21天观察记录创面愈合情况，每个观测点对6只大鼠取材，剪取大鼠背部创面肉芽组织约1 cm×1 cm，放入4%的甲醛中固定。待组织完全固定后石蜡包埋，切片用做免疫组化备用，每组6只大鼠创面肉芽组织均做免疫组化切片。

1.2.4 免疫组化SP法及步骤 (1)石蜡切片，常规脱蜡至水；(2)采用高压热修复，3.5%H2O2去离子水(无色液体)孵育15min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3 min×3次；(3)滴加正常山羊血清工作液室温孵育15 min，倾去，勿洗；(4)滴加适当比例稀释的一抗抗兔抗鼠EGF或VEGF，4℃过夜；(5) PBS冲洗，3min×3次；(6)滴加生物素化二抗山羊抗兔IgG抗体工作液，室温或37℃孵育15min；(7)PBS冲洗，3 min×3次；(8)滴加生物素化二抗山羊抗小鼠IgG抗体工作液，室温或37℃孵育15 min；(9)PBS冲洗，3 min×3次；(10)DAB显色剂显色5 min；(11)自来水充分冲洗；(12)选择适当的封片剂封片。

1.2.5 结果判定标准 创面组织中EGF、VEGF阳性细胞的判断，EGF在新生的肉芽组织中(成纤维细胞、血管内皮细胞及炎性细胞为主)表现为棕黄色、黄褐色颗粒状物。VEGF在成纤维细胞、血管内皮细胞中表达明显，呈棕黄色、黄褐色。光镜下观察细胞浆颜色，无特异性颜色表达者为阴性(－)，轻度表达为黄色(＋)，中度表达为棕色(＋＋)，明显表达为深棕色(＋＋＋)。采用BI－2000医学图像分析系统及MiE图像处理系统并摄片，结果以平均光密度表示，其值大小与平均光密度成正比。

1.2.6 统计学方法 数据采用¯x±s表示，用SPSS 17.0统计软件做单因素方差分析比较组间的差异是否具有统计学意义；P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示有显著性差异。

2 结果

图1 第7、14、21天创面肉芽组织中EGF的表达，a～c:实验组；d～f:对照组；g～i:模型组(SP法，×200)

图2 第7、14、21天创面肉芽组织中VEGF的表达，a～c:实验组；d～f:对照组；g～i:模型组(SP法，×200)

2.1 创面组织中EGF、VEGF水平检测 造模第3天时各组大鼠创面肉芽组织中EGF、VEGF的表达差异不明显，在细胞浆中有少量淡黄色阳性细胞的表达但不均匀，阳性细胞核呈蓝色颗粒状表达。造模第7天时，模型组表现为(＋)，实验组与对照组阳性表现为(＋＋)。造模第14天时，模型组表现为(＋＋)，实验组与对照组表现为(＋＋＋)。造模第21天时，各组阳性细胞的表达均有所下降，模型组表现为(－～＋)，其它2组阳性细胞表现为(＋＋)但仍高于模型组。创面肉芽组织中第21天时对照组VEGF的表达较实验组有所上升(图1、2)。

2.2 大鼠创面愈合过程中各组肉芽组织EGF、VEGF比较 见表1、2。

表1 创面肉芽组织中EGF的表达

表2 创面肉芽组织中VEGF的表达

3 讨论

生肌白玉膏由熟石膏、炉甘石、紫草、当归、甘草、冰片、医用白蜡等组成，实验研究表明熟石膏中Ca2＋离子能抑制神经肌肉兴奋性，减少血管通透性，故有抗炎、镇静、抗过敏、抗渗作用，可明显减少创面渗液，改善创面血液循环。2炉甘石能够改善创面的血液循环，加速创面的新陈代谢，促进伤口成纤维细胞和毛细血管的形成，加快肉芽组织增生，从而加速皮肤创口的愈合。3紫草的主要成分为紫草素，具有较好的抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏等作用，4在创面形成保护层，保持创面滋润，刺激毛细血管再生和肉芽组织形成，并促进参与伤口愈合的生长因子的产生。5已有实验研究表明当归具有抗炎、清除氧自由基的作用，其提取物水剂型相关护肤品具有增加小鼠表皮含水量和提高小鼠皮肤细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用，6故对创面肉芽组织的生长也有一定的促进作用。甘草中所含的甘草黄酮能提高大鼠创面SOD酶活力使小鼠抗应激能力增强。7冰片具有明显的抗炎、抗菌作用，可抑制或杀灭金黄色葡萄球菌、乙型溶菌性链球菌等5种常见细菌，对循环系统有一定的改善作用，可促进药物经皮肤和黏膜的吸收，8提高药物的利用率。以上药物联合运用，共具活血止痛散瘀，消肿生肌敛疮的作用，使气血运行通畅，肌肤得以濡养新生，达到治疗的目的。实验研究表明，重组人表皮生长因子(rhEGF)用于II度烧创面的治疗可以加快创面愈合速度，明显减少愈合时间，抑制创面瘢痕增生且无毒副作用，是一种安全有效的药物。9VEGF可刺激和促进皮肤微血管内皮细胞相关因子的产生和活化，调控内皮细胞结构和功能，10进一步促进创面愈合。

本实验中对创面肉芽组织中不同时间EGF、VEGF表达的检测表明，生肌白玉膏在创面修复过程中能调节EGF、VEGF的表达，EGF可同时作用于成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮细胞和成骨细胞等，具有化学趋化作用，是多种细胞的有丝分裂原，促进细胞由细胞周期NDA合成前期进入DNA合成期，VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，既能促使微血管内皮细胞增殖、迁移，又能增加微血管的通透性，使血液中的大分子物质进入细胞外基质中，形成纤维蛋白凝胶等，有利于新生血管和基质细胞生长。EGF、VEGF表达的升高能明显促进成纤细胞生长，毛细血管新生，进而促进肉芽组织生长，促进创面的修复，因此生肌白玉膏促进烫(烧)伤创面愈合可能与其上调EGF、VEGF的表达具有一定的相关性。

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4李治建，周凡，斯拉甫·艾白，等.紫草药理作用研究进展.中国中医药信息杂志，2010，17(11):110.

5袁汀.紫草制剂治疗烧烫伤研究进展.实用药物与临床，2011，14(5):423－425.

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8陈艳红，冯玉林.冰片的研究进展.中国社区医师，2013，15 (6):10－11.

9邓彪，李延辉.重组人表皮生长因子治疗II度烧伤创面疗效观察.中国医药导刊，2012，14(9):1548－1549.

10刘文忠，恩和吉日嘎拉，康毅敏，等.皮肤创面组织VEGF和MMP－2的表达及意义.内蒙古医学院学报，2009，31(2):85－87.

(收稿:2013－10－22 修回:2013－12－13)

Effects of Shengjibaiyu ointment on the expression of EGF and VEGF in deep second degree scald wounds

WANG Si-nong，ZHANG Bo，LIU Wen-hong，et al.Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，730000

Objective:To evaluate the effects of Shengjibaiyu ointment on the expression of epidermal growth factor(EGF)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in granulation tissue of deep II degree scald wounds in rats.Methods:Eighty ratswere divided into Shengjibaiyu ointment group，MEBO group，saline group and blank group.EGF and VEGF were detected by immunohistochem icalmethod at day 3，7，14，21.Results:The expression of EGF and VEGF in experimental group was higher than those in other groups (P＜0.01).Conclusion:Shengjibaiyu ointmentmay promote the scald wound healing by influencing EGF and VEGF.

Shengjibaiyu ointment；wounds；EGF；VEGF

甘肃省中医药科研项目(编号:GZK－2012－19)

甘肃中医学院，甘肃兰州，730000

∗通信作者