朱明明张玉毅刘凤艳

新乡地区汉族人群寻常型银屑病与HLA－DRB1∗07等位基因的关联研究

朱明明1张玉毅2刘凤艳1

目的: 确定新乡地区汉族人群寻常型银屑病与HLA－DRB1∗07等位基因的相关性。方法:采用聚合酶链反应－序列特异性引物(PCR－SSP)法检测新乡地区200例汉族寻常型银屑病患者和200名健康对照者的HLA－DRB1∗07等位基因频率。结果: 病例组HLA－DRB1∗07等位基因频率(57.5%)高于对照组(27.5%)；发病年龄≤40岁患者等位基因频率(60.47%)高于＞40岁患者(39.29%)。结论: HLA－DRB1∗07等位基因可能与新乡地区汉族人银屑病相关，尤其是早发型银屑病。

寻常型银屑病； HLA－DRB1∗07等位基因； 聚合酶链反应－序列特异性引物

银屑病是一种炎症性角质形成细胞过度增殖性皮肤病，其发病率随地理位置不同而不同。在欧洲一些地区和美国，发病率可达2%～3%，而在日本发病率不到0.1%，据调查我国人群的患病率约为0.123%。1遗传因素在寻常型银屑病的发病中起相当重要的作用，如HLA(人类白细胞抗原)被认为是银屑病最重要的遗传学标志之一。HLA基因的多态性与银屑病的遗传易感性明显相关且HLA基因的连锁不平衡性是形成HLA基因与银屑病相关的基础，各国学者在对不同民族银屑病患者的研究中，已发现一些HLA等位基因与寻常型银屑病(PV)相关。迄今为止，还没有关于HLA－DRB1∗07等位基因与河南新乡地区汉族PV的相关研究报告。本文对河南新乡地区汉族PV与HLA－DRB1∗07等位基因相关性进行了研究。

1 材料和方法

1.1 临床资料 银屑病患者共200例，其中男103例，女97例；年龄3～74岁，平均25岁；≤40岁172例，＞40岁28例；根据银屑病患者I级或II级亲属有无患银屑病可将其分为有家族史患者和无家族史患者两组，有阳性家族史的11例，≤40岁且有阳性家族史的10例。所有患者均为新乡医学院第三附属医院确诊的汉族银屑病患者，彼此之间无任何亲缘关系，且不伴有其他皮肤疾病的表现。200名健康对照为新乡医学院第三附属医院明确的汉族人，其中男107名，女93名；年龄4～77岁，平均28.6岁。两组受试者均为汉族血系，2代以上生活在河南新乡地区的汉族人。

1.2 基因组DNA的制备 使用酚－氯仿法提取DNA。(1)冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL于离心管，加入等体积TE(pH 8.0)，混匀，4℃，10000 r/min离心10 min，弃上清；(2)加入180 μL TE、20μLSDS(10%)、8μL蛋白酶K(10mg/mL)混匀，置于37℃水浴过夜；(3)从水浴中取出样品，轻微离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000 r/min离心10min，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提1次，吸取上清液至一新离心管中；(4)加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150 μL)，混匀，室温10000 r/min离心10 min，转移上清液至一新离心管；(5)加入1/20～1/10体积3 mol/L，pH 5.0醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100%乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000 r/min离心10 min，使DNA沉淀于管底，弃上清；(6)向DNA沉淀加入70%乙醇，漂洗1次，室温7000 r/min离心5 min，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH 8.0)4℃过夜溶解DNA。

1.3 PCR扩增反应 针对HLA－DRBl∗07等位基因，特异性引物按照参考文献设计。2上游引物序列: 5'－CCTGTGGCAGGGTAAGTATA－3'；下游引物序列: 5'－CCCGTAGTGTCTGCTCAC－3'，扩增片段长为232 bp。PCR反应在梯度PCR仪上进行，每个反应25μL体系10×PCR Buffer 2.5μL，Mg2＋2.5μL，P－1 1μL，P－2 1μL，Taq酶0.6μL，dNTP 3μL，灭菌双蒸水9.4 μL，DNA模板5μL。反应体系:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后延伸10 min，共30个循环。扩增结束后，取PCR产物10μL加2μL载样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压为100 V，约50 min)，紫外分析仪观察结果。

1.4 统计学方法 采用χ2检验对患者组及对照组的HLA－DRB1∗07等位基因频率进行比较，计算P值。同时计算相对风险值(OR)，OR＝(携带基因的患者数×不携带基因的对照组人数)/(携带基因的对照组人数×不携带基因的患者数)。

2 结果

2.1 HLA－DRB1∗07等位基因PCR结果 见图1。

图1 HLA－DRB1∗07等位基因PCR结果

2.2 PV患者与健康对照者HLA－DRB1∗07等位基因频率的比较 见表1。

银屑病患者与健康对照者HLA－DRB1∗07等位基因频率比较，差异有显著性意义(χ2＝33.379，P＝0.000)，银屑病患者HLA－DRB1∗07暴露率是健康对照者的4.284倍，(OR＝4.284，95%可信区间2.790～6.578)

表1 银屑病患者与健康对照者HLA－DRB1∗07等位基因频率比较

2.3 ≤40岁与＞40岁银屑病患者之间HLA－DRB1∗07等位基因分布频率比较 见表2。

表2 银屑病患者≤40岁与＞40岁之间HLA－DRB1∗07等位基因频率比较

HLA－DRB1∗07等位基因在≤40岁和＞40岁银屑病患者之间的分布差异有显著性意义(χ2＝4.420，P＝0.036)。

2.4 有家族史及无家族史银屑病患者HLA－DRB1∗07等位基因分布频率比较 见表3。

表3 银屑病患者有无家族史HLA－DRB1∗07等位基因频率比较

有家族史及无家族史银屑病患者HLA－DRB1∗07等位基因分布频率比较，差异无显著性意义(χ2＝2.128，P＝0.145)。

3 讨论

对于HLA－DRB1∗07等位基因与银屑病之间的相关性研究已经在很多地区和国家有相关的报道，Grubic等3报道HLA－DRB1∗07等位基因与克罗地亚人I型银屑病相关。Schmitt－Egenolf等4也发现HLA－DRB1∗0701/02与I型寻常型银屑病显著相关。张庆瑞等5通过PCR/SSP方法对辽宁地区寻常型银屑病患者进行HLA－DRB1检测，结果发现银屑病患者组HLA－DRB1∗0701等位基因频率比对照组明显增高。本实验结果显示病例组HLA－DRB1∗07等位基因频率显著升高，两者呈较强关联。本研究还发现≤40岁患者该等位基因频率显著高于＞40岁患者，提示HLA－DRB1∗07与早发型银屑病(发病年龄≤40岁)更为相关。遗传流行病学调查研究显示，银屑病的发病具有一定的家族倾向性，本研究表明，有无家族史银屑病患者HLA－DRB1∗07等位基因分布频率比较，无显著性差异。

1全国银屑病流行调查组.全国1984年银屑病流行调查报告.中华皮肤科杂志，1986，19(3):253－261.

2Olerup 0，Zetterquist H.HLA－DR typing by PCR amplification with sequence－specific primers(PCR－SSP)in 2 hours:an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor recipientmatching in eadaverie transplantation.Tissue Antigens，1992，39(3):225－235.

3Grubic Z，Zunee R，Kastelan M，eta1.HLA class IIhaplotypie association and DQCARmierosatellite polymorphisms in Croatian patientswith psoriasis.Coil Antropol，2002，26(1):61－67.

4 Schmit－Egenolf M，Eirmann TH，BoehnkeWH，et a1.Familial juvenile onset psoriasis is associated with the human leukocyte antigen(HLA)class Iside of the extended haplotype CW6－B51－DRBl∗0701－DQAl－0201－DQBl∗0303:a population and family based study.J Invest Dermatol，1996，106(4):711－714.

5张庆瑞，冯辉，翟宁，等.中国北方寻常型银屑病与HLADRB1基因关联的研究.中华医学遗传学杂志，1999，16(3): 146－147.

(收稿:2013－11－21 修回:2014－05－29)

Association between HLA－DRB1∗07 allele and psoriasis vulgar in Xinxiang Chinese

ZHU Ming-ming，ZHANGYu-yi，LIU Feng-yan.The Third Affiliated Hospital ofXinxiang Medical University，Henan，453003

Objective:To determine the association between HLA－DRB1∗07 allele and psoriasis vulgar (PV)in Chinese population of Xinxiang.Methods:Allelic frequency of HLA－DRB1∗07 in 200 patients with PV and 200 healthy controlswere detected by PCR－SSP.Results:HLA－DRB1∗07 allelic frequency in patients(57.5%)were higher than that in controls(27.5%).HLA－DRB1∗07 allelic frequency in patients aged≤40 yrs at onset of the disease was60.47%which was higher than that in patients aged＞40 yrs at onset of the disease(39.29%).Conclusion:HLA－DRB1∗07may be associated with PV in Han Chinese population of Xinxiang，especially in the patientswith early－onset psoriasis.

psoriasis vulgar；HLA－DRB1∗07 allele；PCR－SSP

1新乡医学院第三附属医院，河南新乡，453003

2湖北省襄樊市第一人民医院妇产科，湖北襄樊，441000