王晓天 刘晓梅 尤红娟 李小翠 秦苏萍 汤仁仙* 郑葵阳

（徐州医学院病原生物学与免疫学教研室，江苏 徐州 221004）

p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在缺血性脑损伤中的作用研究

王晓天 刘晓梅 尤红娟 李小翠 秦苏萍 汤仁仙* 郑葵阳

（徐州医学院病原生物学与免疫学教研室，江苏 徐州 221004）

目的 探讨p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在大鼠缺血性脑损伤中的作用。方法 ①制作大鼠全脑缺血模型，免疫印迹法检测假手术组、脑缺血复灌6 h、12 h、1 d、3 d组p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达。②免疫印迹法检测假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SB203580组p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表达。结果 ①与假手术组相比，脑缺血再灌注6 h、12 h、1 d、3 d组p-p38MAPK蛋白表达水平逐渐升高，于1 d达高峰（P均＜0.05）。②与缺血复灌组和溶剂对照组相比，SB203580组p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表达水平显著降低（P均＜0.05）。结论 p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在缺血性脑损伤中发挥了重要作用。

p38MAPK；Fas；FasL；凋亡；脑缺血

p38MAPK是MAPK信号通路的重要成员，在炎性反应、应激、休克、细胞迁移等方面发挥着重要作用[1-2]。最近研究发现，p38MAPK信号通路与脑缺血性神经元凋亡关系密切。p38MAPK调控细胞凋亡的机制非常复杂[3-7]，其中p38 MAPK可通过增强Fas/FasL表达促进细胞的凋亡[5]。为此，本实验利用大鼠全脑缺血模型，通过注射p38MAPK特异性阻断剂SB203580，观察其对海马CA1区神经元胞质中p-p38MAPk、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3蛋白表达的影响，探讨p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在缺血性脑损伤中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：正常健康雄性SD大鼠45只，体质量250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂：p-p38MAPK，p38MAPK，Fas，FasL抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司，active-Caspase-3抗体购于Sigma公司，SB203580购于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及动物分组：25只SD大鼠均分为5组：假手术组、脑缺血复灌6 h、12 h、1 d、3 d组。采用四动脉结扎法制作全脑缺血模型[8]，将大鼠麻醉后，分离其双侧颈总动脉并电凝椎动脉，次日于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，再灌注不同时间处死。假手术组的处理同缺血复灌组，但不结扎双侧颈总动脉。

1.2.2 腹腔注射阻断剂SB203580及动物分组：20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SB203580组。SB203580组于脑缺血前30 min腹腔注射SB203580（5 mg/kg，溶于5 mg/mL DMSO）[9]；溶剂对照组于缺血前30 min腹腔注射等体积的DMSO。4组大鼠皆全脑缺血15 min，再灌注1 d处死。

1.2.3 样本制备：各组SD大鼠作不同处理后，断头快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂将其分为CA1和CA3-DG两部分。CA1部分加匀浆缓冲液，匀浆，1000×g离心15 min，小心移取上清液，主要为海马的胞质部分，BCA法测蛋白浓度后行免疫印迹分析。

1.2.4 免疫印迹：取等量的变性蛋白质样本，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，封闭，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育2 h，显色。扫描膜上显色条带并用ImageJ软件分析，蛋白表达相对值以各组蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值来表示。

2 结 果

2.1 脑缺血再灌注不同时间p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达水平的比较：与假手术组相比，脑缺血再灌注6 h、12 h、1 d、3 d组海马CA1区神经元胞质中p-p38MAPK蛋白表达水平逐渐升高，于1 d达高峰，3 d又有所降低，且差异有统计学意义（P均＜0.05），而胞质中p38MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 4组p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表达水平的比较：与假手术组相比，缺血复灌组、溶剂对照组和SB203580组p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表达水平明显增多；与缺血复灌组和溶剂对照组相比，SB203580组p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表达水平显著降低（P均＜0.05）。溶剂对照组与缺血复灌组相比，p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义（P均＞0.05）。4组p38MAPK、Fas蛋白表达水平差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表1 脑缺血再灌注不同时间p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达水平的比较（，n=5）

表1 脑缺血再灌注不同时间p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达水平的比较（，n=5）

注：与假手术组相比，*P＜0.05

蛋白表达相对值 假手术组 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注1 d 再灌注3 d p-p38MAPK 0.253±0.027 0.394±0.031* 0.561±0.043* 0.676±0.048* 0.531±0.041* p38MAPK 0.532±0.041 0.543±0.041 0.556±0.042 0.527±0.040 0.548±0.042

表2 4组p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表达水平的比较（，n=5）

表2 4组p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表达水平的比较（，n=5）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与缺血复灌组和溶剂对照组相比，△P＜0.05

蛋白表达相对值 假手术组 缺血复灌组 溶剂对照组 SB203580组p-p38MAPK 0.251±0.027 0.673±0.048* 0.652±0.047* 0.425±0.036*△p38MAPK 0.521±0.040 0.542±0.041 0.535±0.041 0.554±0.042 FasL 0.263±0.028 0.767±0.050* 0.748±0.049* 0.456±0.037*△Fas 0.465±0.037 0.482±0.039 0.457±0.037 0.471±0.039 Caspase-3 0.213±0.025 0.687±0.048* 0.701±0.049* 0.394±0.032*△

3 讨 论

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是细胞内信号传递的交汇点，可将细胞外信息传递至细胞核，直接调节转录因子活性，调控基因表达[10]。p38MAPK是MAPK信号通路的重要成员，在炎性反应、休克、细胞迁移、细胞凋亡等方面发挥着重要作用。最近研究发现，p38MAPK信号通路与缺血性脑损伤密切相关[11]。大鼠局灶性脑缺血再灌注24 h，缺血区脑组织p38MAPK的活性增强并伴随神经元的凋亡，表明p38MAPK在脑缺血后神经元凋亡的过程中起重要作用[12-13]。我们的实验结果也显示：大鼠全脑缺血再灌注后6 h、12 h、1 d、3 d，海马CA1区神经元胞质中p-p38MAPK蛋白表达水平逐渐升高，于1 d时达高峰，而胞质中p38MAPK蛋白表达水平无明显差异。结果提示：脑缺血再灌注后有p38MAPK的激活。

p38 MAPK经多条途径调控细胞凋亡，其中p38 MAPK可通过增强Fas/FasL表达促进细胞的凋亡。Fas蛋白是细胞凋亡信号的受体，Fas配体（FasL）属肿瘤坏死因子超家族。Fas/FasL系统在细胞凋亡中起重要作用。研究发现[14]，在小鼠局灶性脑缺血模型中，脑缺血模型组FasL表达比假手术组增加了451.67%。而我们以前的实验结果[15]也显示：脑缺血再灌注后FasL表达增高。为了证实在脑缺血复灌过程中p38 MAPK是否可通过Fas/FasL通路促进细胞凋亡，我们选用了p38MAPK的特异性阻断剂SB203580作为工具药进行研究。SB203580是吡啶咪唑芳基杂环类化合物，与p38MAPK竞争性结合ATP位点，使p38MAPK失去与ATP结合的能力，从而高效抑制p38MAPK的磷酸化，使其失去激酶活性，最终实现对p38MAPK通路的抑制。我们的结果显示：与缺血复灌组和溶剂对照组相比，SB203580组p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表达水平显著降低；而p38MAPK、Fas蛋白表达水平无明显差异。提示：p38MAPK可通过Fas/FasL信号通路诱导神经元凋亡。

总之，本实验证实了脑缺血复灌过程中有p38MAPK的激活，并通过其阻断剂SB203580证实p38MAPK能经Fas/FasL信号通路诱导神经元凋亡。因此，p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在缺血性脑损伤中发挥了重要作用，为临床进一步阐明人类脑缺血发病机制提供了实验依据，且为防治人类缺血性脑病提供了新的思路。

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Study of the Effects of Apoptosis Induced by p38MAPK through Fas/FasL Pathway on Ischemic Brain Injury

WANG Xiao-tian, LIU Xiao-mei, YOU Hong-juan, LI Xiao-cui, QIN Su-ping, TANG Ren-xian*, ZHENG Kui-yang
(Department of Pathogenic Biology and Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

Objective Investigate the effects of apoptosis induced by p38MAPK through Fas/FasL pathway on ischemic brain injury in rats. Methods ①Making rat model of cerebral ischemia, p-p38MAPK and p38MAPK protein expression were detected by immunoblotting in sham operation group, ischemiareperfusion(I/R) 6 h, 12 h, 1 d, 3 d group. ②p-p38MAPK, p38MAPK, FasL, Fas and Caspase-3 protein expression were detected by immunoblotting 1d after I/R in sham operation group, I/R group, solvent control group and SB203580 group. Results ①Compared with the sham operation group, p-p38MAPK protein expression were increased gradually in I/R 6 h, 12 h, 1 d, 3 d group, and reached the peak in I/R 1d group (All P＜0.05). ②Compared with the I/R group and solvent control group, p-p38MAPK、FasL and Caspase-3 protein expression were decreased in SB203580 group (All P＜0.05). Conclusion Neuronal apoptosis induced by p38MAPK through Fas/FasL pathway played important effects on ischemic brain injury in rats.

p38MAPK; Fas; FasL; Apoptosis; Cerebral ischemia

R651.1+5

：B

：1671-8194（2014）31-0001-02

江苏省教育厅资助项目（14KJB310023）

*通讯作者:E-mail: tangrenxian-t@163.com