曲茂华，张凤英，何名芳，陈卫平

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C12H22O11·2H2O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生菌、真菌，以及一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。甚至在可以用于清理核污染的抗辐射型细菌如耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）[1]中也发现了海藻糖的存在。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用[2]；增强农作物抗逆性[3]，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物[4]，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业。因此，对海藻糖进行研究具有重要意义，本文针对海藻糖生物合成、作用机理、应用方面的最新研究进展进行综述。

1 海藻糖合成的相关酶以及调控途径

1.1 海藻糖合成途径

目前对海藻糖合成代谢途径的研究文献较丰富。研究发现在生物体内的海藻糖合成途径主要有以下几条：一是OtsAB途径，通过TPS（Trehalose-6-phosphate synthase，6-磷酸海藻糖合成酶）和TPP（Trehalose-6-phosphate phosphatase，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶）酶来形成海藻糖[5]。在酵母细胞内通过TPS1和TPS2酶来合成海藻糖[6]，如酿酒酵母；而其他一些真菌中的海藻糖合成途径还有一些辅助性的且作用不是很明显的酶的参与，如TPS3和TSL1[7]。二是TreYZ途径，是在Arthrobacter sp.中发现的，通过两步催化反应来合成海藻糖[8]。三是TreS（Trehalose synthase，海藻糖合酶）途径，该途径目前只在细菌中被发现，TreS酶活具有可逆性[9]，在谷氨酸棒状杆菌中，TreS酶在细胞内海藻糖过量情况下会将海藻糖转化为麦芽糖，以调节细胞内海藻糖浓度平衡[10]。除以上几种途径外，还有两条海藻糖合成途径，分别为TreT（Trehalose glycosyltransferase，海藻糖糖基转移酶）途径和TreP（Trehalose phosphorylase，海藻糖磷酸化酶）途径，这两条途径与TreS途径一样，具有可逆的催化活性[11]。

Mladen Tzvetkov等[12]对谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）进行研究，但研究重点在于弄清其中三条海藻糖合成途径的影响大小。研究表明，OtsAB途径和TreYZ途径是细胞内合成海藻糖的两条主要途径，而TreS途径不是细胞内海藻糖的主要合成途径。通过OtsAB途径合成1mol的海藻糖需要消耗1mol葡萄糖-6-磷酸以及1mol的UDP-葡萄糖，但通过TreYZ途径合成1mol海藻糖需要消耗2mol ADP-葡萄糖（用于糖原合成），并且细胞往往会优先选择TreYZ途径而不是OtsAB途径来合成海藻糖，而且在C.glutamicum培养基中添加微量的糖类碳源，细胞仅通过TreYZ途径就可以完全满足对海藻糖的需要。

1.2 海藻糖合成酶活性位点及调控途径

在分子水平对海藻糖合成酶进行研究的难度相对较高，目前在此方面研究进展较为缓慢，最大突破是TreS酶与MTHase（Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，麦芽寡糖基海藻糖水解酶）三维结构测定。

英国科学家以具有产海藻糖能力的结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）[13]作为研究菌株，对细胞内TreS酶进行检测和分析，详细阐述了海藻糖合酶作用机制及其三维结构，发现TreS酶活可以整合到其他产物的合成途径中[14]。TreS属于糖苷水解酶家族（Family GH13）[15]，其结构由两段保守区域组成，一个是催化区域（（β/α）8 barrel-like折叠，也称TIM barrel折叠），另一个是C-末端β-夹心结构区域。其中靠近酶活性位点的β3-β4环状结构是钙离子结合位点，但是其功能尚不明确。β7-β8环状结构主要作用是在底物催化过程中固定底物，使底物在整个催化过程中一直固定于酶活性位点上。在催化麦芽糖时，催化反应一直在酶的活性位点上进行，其间所形成的葡萄糖单体不会释放，直到葡萄糖单体重新合成出海藻糖为止。另外，产物也是通过β7-β8环状结构固定于酶活性位点上，当产物需要释放时，β7-β8环状结构中所含的两个保守区域中的氨基酸发生替换（Ser（丝氨酸）替换了 Thr（苏氨酸）；Asp（天冬氨酸）替换了Ser），使得环状结构发生重构而失去固定作用，将产物释放到溶液中并接纳新的底物。

MTHase是海藻糖合成途径中一种重要的a-淀粉酶[16]。该酶与MTSase（Maltooligosyltrehalose synthase，麦芽寡糖基海藻糖合成酶）协同作用，切割中间产物化合物中的α-1，4糖苷键生成海藻糖，该过程对海藻糖的形成起着至关重要的作用。研究发现[17]，Asp252（天冬氨酸）与Glu283（谷氨酸）位于MTHase的催化位点处，在实验中构建突变株：D252S（Ser替换了Asp252）、D252E（Ser替换了Glu283）、E283Q（Gln（谷氨酰胺）替换了Glu283），同野生型菌株比较，它们的酶活性仅为对照组野生菌株酶活性的0.04%、0.03%和0.6%。对突变株与野生型菌株所产生的MTHase进行结构分析以及底物催化实验，结果表明，使用Ser或Thr替换Asp252后，在反应时在活性位点酶与底物之间会插入一个水分子，这样会使原先的双取代机制变为单一取代机制，对Glu252进行替换后，反应中会形成稳定的酶-底物复合物。Asp252与底物所发生的双取代反应有直接关系，Glu则控制底物或产物的释放。

2 海藻糖生产应用研究

2.1 海藻糖生产方法

海藻糖生产目的是为了获得高纯度海藻糖产品以及相关酶产品[18]。目前在实验室和生产上制备海藻糖主要有三种方法：一是从生物细胞中提取；二是采用微生物发酵生产；三是采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。

发酵法：由于微生物生长旺、繁殖快，易于培养，采用深层发酵海藻糖具有先天的优越性，利用产海藻糖酵母、细菌等为出发菌株，选育出产海藻糖高产菌株，发酵生产海藻糖，再采用有效分离提取的方法提取和精制。

酶合成法：酶合成法是采用微生物发酵产生并提取相关海藻糖合成酶类，以各类碳水化合物为底物来合成海藻糖。酶的最大缺点是其脆弱性，容易失活，实际生产中使用相关合成酶进行海藻糖生产，要考虑保持酶活性和酶类制剂的成本，可使用酶固定化或细胞固定化技术来保护酶类。目前，海藻糖酶的固定化这方面研究比较少。

2.2 海藻糖相关菌株筛选与改良

无论采用发酵法或酶法生产海藻糖，获得优良菌株对海藻糖工业化生产具有重要价值，如能采用基因工程等技术获得可在胞外积累的菌株生产海藻糖，对于提高生产效率有较大意义。

海藻糖合成方面可以使用的菌株非常广泛，包括酵母、根霉、细菌以及一些藻类都可以生产海藻糖。

在酵母菌方面，一般使用的菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）以及耐寒性酵母（Guehomyces pullulans）等，它们都可以在细胞内通过TPS1与TPS2酶催化生产海藻糖[19]，直接用抽提法从酵母菌中获取海藻糖，但是这种方法效率偏低。François J M等[20]重点研究探讨了Saccharomyces cerevisiae中与海藻糖合成有关基因调控机制，对酵母细胞内海藻糖提取工艺进行一定程度的优化。

除了用酵母外，海藻糖生产菌株主要集中于杆菌属和球菌属等菌株[21]。如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）、浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）、丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）及耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）等菌株，都可以用于生产海藻糖[22]。大肠杆菌在渗透压胁迫环境中也可以积累内源性海藻糖，大肠杆菌虽然可以生产海藻糖，但需要通过基因改良除去细胞中的海藻糖酶才能应用于工业生产，并且需要进一步考察在海藻糖过量情况下海藻糖对大肠杆菌细胞的不利影响，这也是使用大肠杆菌来生产海藻糖的研究重点[23]。Mary Jackson等研究了Mycobacterium tuberculosis中海藻糖合成代谢机制[24]，并对相关基因调控进行总结，得到有效生产海藻糖的改良型突变株。结核杆菌虽能有效地在细胞内积累海藻糖，但结核杆菌属于致病菌，不建议用于海藻糖工业化生产。

嗜热菌株中可用于海藻糖生产的菌株有嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）、红色亚栖热菌（Meiothermus ruber）、高温单胞菌（Thermomonospora curvata）及一些极端嗜热的古生菌如耐超高温热棒菌（Pyrobaculum aerophilum）、硫矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）与热球菌（Pyrococcus horikoshii）等[25]都可以在高温环境中积累海藻糖，并在菌种改良后投入工业化生产，但要考虑发酵环境以及相关设备耐热性及能耗等因素。嗜热菌株中海藻糖合成途径普遍只有海藻糖合酶途径。由于海藻糖合酶活性可逆，因此海藻糖产量不很稳定。在嗜热菌筛选过程中，取样点最好选在温度极高（最好在45℃以上）的地方，如活火山口，工厂废热水排放口等常年高温的环境。

另外，嗜极菌如嗜酸菌（Picrophilus torridus）[26]等也可生产海藻糖。

采用基因测序方法来筛选海藻糖合成菌株并通过转基因或基因敲除等手段改良现有生产菌株[27]，可使得海藻糖产量有较大幅度提高。目前在新菌株找寻以及现有生产菌株改良方面，使用基因工程手段对菌株进行直接操作的人工定向基因突变技术，正代替以往使用的紫外诱变等非定向基因突变育种技术。而紫外诱变以及化学试剂诱变仍是有效的菌种改良手段[28]，如在谷氨酸棒状杆菌诱变育种中，选择IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）作为诱变剂，可以有效地培育出海藻糖高产突变株，而NTG（亚硝基胍）对谷氨酸棒状杆菌几乎没有诱导作用[29]。但是紫外诱变和化学诱变方法弊端比较大，比如正突变相对过少，筛选过程繁琐等。

3 海藻糖对生物细胞保护作用机理

目前，相关研究主要集中在细胞处于各种不利环境（如寒冷、干旱、高离子浓度等）中时，海藻糖对细胞的保护机理[30]。当细胞处于寒冷环境中时，含有海藻糖的细胞耐冻性要高，这是由于海藻糖的存在提高了细胞中溶质浓度，有效降低细胞质的冰点。在缺水状态下，细胞中会积累大量的海藻糖，这些海藻糖可以在细胞脱水状态下与脂类物质形成化合物（Trehalose dinocardiomycolates）来维持生物膜结构[31]，阻止细胞内囊泡溶解，并且降低脂类物质发生变质，保持脂类物质的正常状态和功能[32]。

海藻糖应对干燥环境的机制是形成玻璃化结构[33]。海藻糖会形成一种类似于玻璃态的结构，这种结构表面形成海藻糖二水化合物，将水分子牢牢的固定在细胞内，从而阻止水分的流失，维持细胞的整体结构。有研究表明，盐分胁迫对生物细胞有两方面的影响[34]，一是造成渗透压差，使细胞内水分流失；二是在细胞周围制造一个高离子强度的环境。细胞自身的适应性调节是在细胞质中积累大量可溶性溶质[35]，这些溶质对于缓解细胞所遭受的盐分胁迫具有两方面的抵御作用[36]，一是降低细胞内外浓度差，二是稳定细胞内蛋白质结构与功能。

Andreas Wolf等[37]对谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）中海藻糖作用机制以及酶调控机制进行深入研究与探讨，通过对这些突变株的环境耐受性进行测定与分析，海藻糖可以通过与细胞中的脂质形成化合物来保护生物膜，维持谷氨酸棒状杆菌细胞的稳定性。

4 海藻糖的应用

4.1 在食品工业中的应用

海藻糖在食品工业中的应用主要体现在两方面：

4.1.1 作为保护性添加剂使用 由于海藻糖在氢离子较高的条件下能保持相对稳定状态[38]，在含氨基酸或蛋白质的沸水中不会发生美拉德反应特性，可以使食品中营养性风味物质保存完好[39]，有效延长食品相关产品货架期。将海藻糖添加进淀粉类食品中，可以有效防止在常温和低温下淀粉类食品老化现象[40]，改善食品品质。另外，海藻糖处于无定形状态时极易吸收水分，可以作为食品优良的安全干燥剂[41]。

4.1.2 作为食用性糖类开发新型食品 将海藻糖作为一种高级食用糖来进行工业化生产[42]，需要考虑相关成本问题。与几十年前初期相比，目前海藻糖工业化产量有较大幅度提升，但如果用作食用糖，其成本依然比普通糖类如蔗糖等要高，并且涉及到菌株改良以及提取工艺等一系列问题，大规模用作食用糖还需很长的路要走。目前，海藻糖的食用性仅仅体现在食品添加剂层面[43]。

4.2 医学领域中的应用

生物制剂对环境的敏感性很高，生物医学领域中涉及到的材料多属于容易失活的生物制剂，如何提高生物制剂对于环境的抗逆性[44]，降低保存成本并延长保存期，是该领域要研究的关键问题。相关研究结果表明，通过添加海藻糖或转基因手段将海藻糖相关酶类的调控基因片段导入到细胞内，增强相关生物制剂的环境抗逆性[45]，并具有显著效果。Nan Zhang等[46]利用转基因技术将藻类中与海藻糖合成有关的基因片段导入到酵母细胞中，研究酵母在高盐浓度下的细胞存活率与海藻糖的生产率之间的关系，与对照组相比，导入海藻糖相关合成基因的细胞能够在极高渗透压环境中生存，而且环境中盐浓度越高，细胞内海藻糖的浓度也相应越高直到达到最大值。

4.3 农业方面的应用

海藻糖对于果蔬植物环境抗逆性的提高也有重要意义。Jin Duan等[47]通过实验将假单孢菌（Pseudomonas sp.）海藻糖合成酶相关基因片段导入植物细胞，与对照组相比，在寒冷、重金属存在、干燥等各种极端环境中，细胞内积累海藻糖的植物抗逆性有明显改善。此外，根据Theerakulpisut的最新研究显示[48]，使用海藻糖溶液处理后的水稻种子，可以在高盐浓度环境中生长，能有效减轻NaCl对细胞中叶绿素的损害，同时降低细胞内Na+与K+含量的比值，促进水稻发芽和生长。

将调控海藻糖合成相关基因导入到其他物种中，培育出抗逆性强的改良物种[49]。这方面研究应用性非常强，主要用于培育抗旱抗寒以及抗盐碱型农作物[50]，使得植物可以适应更加恶劣的环境。

5 结论

海藻糖是生物细胞抵抗不良环境的应激代谢产物，海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分维持空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分的流失。

相关研究表明：海藻糖在生物体内的合成，主要有OtsAB途径、TreYZ途径、TreS途径、TreT途径和TreP途径，后三条途径具有可逆的催化活性。对海藻糖代谢调控机制还不完全清楚，仅停留在对海藻糖合酶（TreS）与麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）三维结构研究。同时，很多研究成果仅局限在初步明确了几条海藻糖合成途径，对海藻糖合成途径中相关酶类研究仍然不足。

目前在实验室和生产上制备海藻糖主要有三种方法：一是从生物细胞中提取；二是采用微生物发酵生产；三是采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。目前快速发展的生物技术促进了对海藻糖的研究。更需要对海藻糖相关生产菌株进行深入研究，重点在于培育出产量较高的生产菌株以及开发出相关生产工艺。对相关酶类代谢机制以及酶三维结构分析的研究是目前该领域研究热点，随着现代分子生物技术大幅度进步以及更先进分析仪器和相关配套软件的出现与应用，形成了软硬件相互结合并行研究的新局面，在海藻糖基础领域研究一定能取得新的进展。

海藻糖应对干燥环境的机制是形成玻璃化结构，阻止水分流失，维持细胞整体结构。在高渗环境中，海藻糖可以有效降低细胞内外浓度差，稳定细胞内蛋白质结构与功能。由于海藻糖是一种非还原性二糖，不会发生美拉德反应，能保护生物细胞和抵抗不良环境，因此，被广泛用于食品、化妆品、生物医药和农业等领域。

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