董伟杰 秦世炳 赵立平 付育红 黄海荣

骨关节结核是除结核性胸膜炎和淋巴结核外最常见的肺外结核，约占结核病患者的1%～3%[1]。临床上骨关节结核的诊断是一个难点，患者从首次出现症状到最后确诊往往需要几个月甚至几年的时间。近年来，随着磁共振成像(MRI)技术[2]的推广使用，使得骨关节结核诊断所需时间大大缩短。虽然结核病的细菌学诊断是最直接可靠的证据，然而骨关节结核却往往由于标本的不易获得和培养阳性率低等原因，在骨关节结核的诊断中没能发挥重要作用。为了解标本的性质和培养方法对培养阳性率的影响，笔者观察了骨关节结核病灶中脓液、肉芽、死骨及干酪坏死组织的BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)培养及改良罗氏培养的培养阳性率，以期为将来骨关节结核标本的留取和培养方式的选择提供依据，提高骨关节结核的细菌学诊断水平。

对象和方法

一、研究对象

选取2011年6月至2012年5月北京胸科医院收治的术前通过CT及MRI发现存在脓肿及死骨，后经病理检查明确诊断为骨关节结核的全部患者50例，其中男26例，女24例；年龄范围为15～84岁，平均(40.7±19.6)岁；60岁以上老年患者9例(18.0%)；根据患病部位分为脊柱结核40例，关节结核8例，胸骨关节结核2例。所有患者均接受病灶清除手术，术中取得病灶中的脓液、干酪、肉芽及死骨组织，分别进行结核分枝杆菌MGIT 960 培养及改良罗氏培养，另外对所有的脓液标本开展了结核分枝杆菌PCR检测。本研究标本为常规送检标本中的剩余标本，已通过北京结核病胸部肿瘤研究所伦理委员会审核。

50例患者通过病灶清除术共分离出脓液标本50份、干酪标本42份、肉芽标本48份及死骨组织标本43份，其中有37位患者同时获取了全部4种类型的标本。

二、实验方法

1.标本处理：脓液标本依照《结核病诊断实验室检验规程》[3]中的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氢氧化钠法进行标本处理。干酪、肉芽及死骨组织在加入适量磷酸盐缓冲液后，应用微型研磨器Fastprep-24(美国MP Biomeidcals公司)进行匀浆，之后直接接种。

2.罗氏培养：接种后的改良罗氏培养基置于37 ℃培养，每周检查一次细菌的生长状态直至有菌落生长为止。以结核分枝杆菌标准株H37Rv作为阳性对照，以空白管作为阴性对照。

3. MGIT 960培养：接种后的MGIT 960培养管放入MGIT 960全自动细菌培养系统(美国BD公司)中进行培养，以结核分枝杆菌标准株H37Rv作为阳性对照，以空白管作为阴性对照。

4.结核分枝杆菌PCR检测：采用达安基因公司生产的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒，阳性对照、阴性对照设置及其他具体操作见产品说明。

三、统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料采用百分率表示。

结 果

所有标本的改良罗氏培养结果，MGIT 960培养结果及PCR检测结果见表1。依据MGIT 960培养阳性率排列4种标本顺序为：死骨组织(41.9%，18/43)>脓液(40.0%，20/50)>肉芽(33.3%，16/48)=干酪(33.3%，14/42)；依据罗氏培养阳性率排列4种标本顺序为：肉芽(20.8%，10/48)>脓液(20.0%，10/50)>死骨组织(16.3%，7/43)>干酪(14.3%，6/42)。以50例患者所取的4种标本中1种标本或以上培养阳性评价两种培养方法，则MGIT 960 培养阳性率为42.0%(21/50)，罗氏培养阳性率为30.0%(15/50)；两种培养方法的联合阳性率为 50.0%(25/50)。

50份脓液标本单独进行了PCR检测，其中有24份PCR检测阳性，阳性率为48.0%(24/50)。24份PCR检测阳性的脓液标本中有18份培养也获得阳性结果，另有6份标本培养阴性。PCR检测、MGIT 960及改良罗氏培养3种方法的联合阳性率为68.0%(34/50)。

表1 脓液、干酪、肉芽及死骨组织的MGIT 960、罗氏培养及PCR阳性情况

讨 论

骨关节结核的诊断目前可以依赖的手段包括影像学检测、病理学检测和病原微生物学检测。由于长期以来骨关节结核患者的结核分枝杆菌培养阳性率较低[4]，临床上主要依赖影像学检查进行诊断，依靠术后病理检查进行最后确诊，而作为结核病诊断最为直接可靠的细菌学检查技术常得不到临床医生的重视。为了探讨如何提高骨关节结核患者获得细菌学诊断的比例，笔者开展了此项研究。

本研究发现，通过选取骨关节结核病灶中的脓液、肉芽组织、死骨及干酪坏死组织等多种标本，联合使用BACTEC MGIT 960培养和改良罗氏培养可以获得50.0%的培养阳性率。这一阳性率远高于吴启秋等[5]报道的应用BACTEC TB460检测仪选取脓液、干酪坏死组织及肉芽组织进行培养获得的18.4%的培养阳性率。进一步分析发现，除了增加罗氏培养小幅度提升了培养阳性率外，标本的处理方式对于阳性率提高有非常重要的作用。本研究中分离到的死骨组织的MGIT 960培养阳性率高于脓液及肉芽组织，这一结果出乎试验设计之初的预期。本试验中，笔者将死骨组织经微型研磨器打碎离心处理后进行常规培养，获得的MGIT 960培养阳性率为41.9%(18/43)，高于骨关节结核患者最常留取的脓液标本的培养阳性率(40.0%，20/40)。由此表明，未来临床医生在骨关节结核手术中，应该尽量留取多种标本并根据标本选取恰当的标本处理方式，以提高后续培养的阳性率。

本研究中，4种类型标本MGIT 960培养的阳性率都较相应的罗氏培养阳性率高，提高程度从12.5%到25.6%不等，表明MGIT 960培养比罗氏培养更适用于骨关节结核患者的标本培养。然而对于所纳入的50例患者，有4例患者仅罗氏培养获得阳性结果，由此表明在条件允许的时候同时开展两种培养有利于提高总体阳性率。对所有的脓液标本进行PCR检测，再联合改良罗氏培养及MGIT 960培养可使本组标本的总体阳性率达到68.0%。这从一个侧面提示，骨关节结核病灶中的病变组织若得以妥善分离利用，并综合利用目前成熟的微生物学培养方法及分子生物学技术将对骨关节结核的诊断大有裨益，对缩短诊断时间亦有积极意义。目前，对于早期骨关节结核的诊断，通常采用病变部位穿刺的办法获得标本，但在脊柱结核，由于解剖位置深，往往获得的组织量微小[6]，除常规送检病理外，如何通过分子生物学技术对穿刺标本进行处理，以获得微生物学诊断依据，亦不失为日后努力的方向。

骨关节结核获得细菌学证据不仅有利于确诊，而且还为后续的细菌学研究提供了条件。以本研究为例，笔者对10株罗氏培养阳性的菌株开展了后续的药敏试验，其中5株被确定为耐药菌株，而其中又有3株为耐多药菌株。鉴于骨关节结核患者在手术之后仍然需要进行抗结核化疗，而早期获得患者耐药及药敏结果，并给予合理的抗结核治疗并结合合理的手术方法是治愈的关键[7]，因此获得药敏试验结果对于指导化疗方案的选择意义重大，而提高骨关节结核的阳性培养率是开展传统药敏试验的前提。

传统的培养和药敏试验有些耗时过长，影响了其对临床的指导价值。新兴的一些分子生物学技术如GeneXpert[8-9]尤以其能够进行快速药敏诊断而深受临床欢迎。本研究至少提示未来开展新的分子诊断技术时，可以恰当地选择术中取得的组织来进行有效检测，以早期获得药敏试验结果，以便及时发现耐药患者，调整治疗方案，以减少术后并发症的发生。

总之，本研究的结果表明，对于骨关节结核患者，除了留取常规的脓液标本外，应尽可能选择多种标本以提高培养阳性率。MGIT 960培养可以作为首选的细菌学诊断方法，但如果再联合使用改良罗氏培养和PCR扩增技术，能够进一步提高检出阳性率。

[1] Caws M, Thwaites G, Dunstan S, et al.The influence of host and bacterial genotype on the development of disseminated di-sease withMycobacteriumtuberculosis. PLoS Pathog, 2008，4(3):e1000034.

[2] Pursey J, Stewart S. Potts disease: diagnosis with magnetic resonance imaging. Radiography, 2010,16(1): 84-88.

[3] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育文化出版社，2006.

[4] 赵雁林，尚美.我国结核病实验室诊断的现状.中华检验医学杂志，2007,30(7)：725-728.

[5] 吴启秋，潘毓萱，毕志强，等. 骨关节结核病灶中耐多药结核分枝杆菌对疗效的影响. 中华骨科杂志,2005,25(7): 431-433.

[6] 大会学术委员会. 骨关节结核诊疗共识(讨论稿).结核病与肺部健康杂志，2012，1(3)：206-212.

[7] 秦世炳，董伟杰，兰汀隆，等.128例脊柱结核耐药患者的临床分析.中国防痨杂志,2013,35(5)：299-304.

[8] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med,363(11):1005-1015.

[9] 张治国，欧喜超，孙倩，等. 利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究. 中国防痨杂志, 2013,35(1):13-16.