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(哈尔滨商业大学,食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)

α - 亚麻酸(α - Linolenic acid)即9,12,15 - 十八碳三烯酸,它是一种高级多不饱和脂肪酸,分子式为CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH[1]。它以甘油酯的形式存在于亚麻籽油、苏子油等干性油中,为淡黄色液体,熔点 - 11. 3℃,沸点230 ～ 232℃(17mmHg),相对密度0. 9164,可溶于乙醇和乙醚。α - 亚麻酸是一种人体自身无法合成的必需脂肪酸,它是维系人类脑进化的核心物质,到达α - 亚麻酸代谢的历程终端,将形成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,即EPA和DHA[2],这两者都是神经细胞膜的重要组成成分。其中,EPA具有降低血脂和改善血小板凝固的作用,可预防脑血栓和心肌梗塞等疾病。自上个世纪80年代以来被公认为人类有效的保健食品之一。而DHA则具有促进神经系统发育、视网膜反射能力和提高记忆力、预防癌症、预防老年痴呆症和抗过敏症等功效[3]。

近年来,β - 环糊精包合技术的主要原理是利用物质扩散至β - 环糊精的空穴中,形成环糊精的包合进行纯化,它可与许多无机、有机分子结合成主客体包合物,并能改变被包合物的化学及物理性质,具有稳定、保护、增溶客体分子和选择性定向分子的特性[4],因而β - 环糊精包合技术在食品、医药、环境、高分子合成、化妆用品以及化学检测等方面都有广泛的应用[5]。利用环糊精包埋复合物的研究趋于成熟,并开始在某些领域得到应用。环糊精最常见的主要有环糊精α、β、γ三种,其中β - 环糊精应用最为广泛[6]。不管是在国外还是国内市场,α - 亚麻酸都具有广泛需求,且人们对其进行提取、纯化的方法具有多样性[7]。因此,本实验对β - 环糊精包合法纯化混合脂肪酸中α - 亚麻酸的工艺条件进行优化,利用响应曲面法进一步优化提取方法。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

亚麻籽油 市售;无水乙醇 分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;氢氧化钠 分析纯,黑龙江阿城化学试剂厂;盐酸 优级纯,哈尔滨新达化工厂;无水乙醚 分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;无水硫酸钠 分析纯,天津塘沽邓中化工厂;β - 环糊精 天津市光复精细化工研究所;混合脂肪酸 亚麻籽油提取得到。

DK - 98 - 1型电子恒温水浴箱 天津市泰斯特仪器有限公司;ALC - 1100. 2型电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;便携式pHS - 3C型数字精密pH计 中国上海仪器厂;TU - 1900型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;R - 205型旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司;MC型精密电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DHG - 9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;KQ - 500VDE型双频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 α - 亚麻酸定量分析实验

1. 2. 1. 1 标准曲线的绘制 分别取不同体积浓度为为0. 2mg/mL的α - 亚麻酸标准溶液,定容至25mL。分别于最大吸收波长处测其吸光值,以α - 亚麻酸质量浓度(μg/mL)为横坐标,最大吸收波长下的吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。

1. 2. 1. 2 α - 亚麻酸含量的测定 α - 亚麻酸的含量计算方程如下:

注:W- α - 亚麻酸含量/%;m- 富含α - 亚麻酸的质量/g;M- 亚麻油混合脂肪酸的质量/g。

1. 2. 2 β - 环糊精包合法提取α - 亚麻酸单因素实验

1. 2. 2. 1 包合温度对α - 亚麻酸含量的影响 称取5份等量的β - 环糊精各18g放入烧杯中,加入适量的热水配成饱和溶液,在恒温条件下,分别搅拌至规定温度(30、40、50、60、70℃),然后分别加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g无水乙醇的混合液,恒温搅拌2h,冷却后置于冰箱中冷冻18h,待溶化后抽滤洗涤,置于80℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥3h后,得到白色粉末状α - 亚麻酸 - β - 环糊精包合物。将包合物置于烧瓶中,加适量乙醚,在40℃恒温水浴锅中回流1h,减压抽滤回收乙醚,即得富含α - 亚麻酸的脂肪酸[8]。

1. 2. 2. 2 β - 环糊精用量对α - 亚麻酸含量的影响 称取5份等量分别为2g混合脂肪酸(FFA)和1g无水乙醇配成混合溶液。按照β - 环糊精:(FFA+无水乙醇)的不同比例,分别称取一定量(12、15、18、21、24g)的β - 环糊精,在恒温条件下搅拌至50℃后,加入混合液恒温搅拌2h,冷却后置冰箱冷冻18h,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 2. 3 包合时间对α - 亚麻酸含量的影响 称取5份等量的β - 环糊精各18g放入烧杯中,加入适量热水配成饱和溶液,在恒温条件下搅拌至50℃,分别加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g无水乙醇的混合液,恒温搅拌一定时间(1、1. 5、2、2. 5、3h),冷却后置冰箱中冷冻18h,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 2. 4 冷冻时间对α - 亚麻酸含量的影响 称取5份等量的β - 环糊精各18g放入烧杯中,加入适量热水配成饱和溶液,恒温搅拌至50℃后,加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g无水乙醇的混合溶液,恒温搅拌2h,冷却后置于冰箱中冷冻一定时间(6、12、18、24、30h)后,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 3 响应曲面法优化α - 亚麻酸提取工艺条件 采用Box - Behnken模型,以包合温度、包合时间和β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量之比三个单因素为影响α - 亚麻酸含量的主要考察因子(自变量),分别以x1、x2、x3表示,并以 - 1、0、+1分别代表自变量的低、中、高水平,按方程xi=(xi- xo)/x对自变量进行编码。其中xi为自变量的编码值,Xi为自变量的真实值,xo为实验中心点处自变量的真实值,x为自变量的变化步长,因子编码及水平见表1。并采用多元回归分析,拟合二次多项式回归模型的Box -Behnken设计实验[9 - 10],进行结果分析,得到β - 环糊精包合法分离亚麻油中α - 亚麻酸的优化工艺条件。

2 结果与讨论

2. 1 α - 亚麻酸定量分析

标准曲线的绘制结果:在300nm下测定不同浓度α - 亚麻酸标样的吸光值,拟合得回归方程:y=0. 0047x+0. 0804(R2=0. 9973),有效线性范围:70 ～310μg/mL,绘制标准曲线见图1。

图1 α - 亚麻酸标准曲线Fig. 1 The standard curve of α - linolenic acid

2. 2 β - 环糊精包合法提取α - 亚麻酸单因素实验

2. 2. 1 包合温度对α - 亚麻酸含量的影响 从图2中可以看出,随着包合温度在30 ～ 60℃之间逐步上升,α - 亚麻酸的含量显示出逐渐增加的趋势,这是因为β - 环糊精包合物的形成是一个吸热过程,温度增高时,反应向生成β - 环糊精包合物的方向进行,包合温度随不饱和度的增加而增加,包合温度的增长有利于不饱和脂肪酸与β - 环糊精形成包合物。当温度高于60℃时,β - 环糊精的包合能力开始下降,α - 亚麻酸的含量开始降低。由此可见,包合温度为60℃时,提取效果最佳,α - 亚麻酸的含量为38. 4%。

图2 包合温度对α - 亚麻酸含量的影响Fig. 2 The effect of bonding temperature to α - linolenic acid content

2. 2. 2 包合时间对α - 亚麻酸含量的影响结果与分析 从图3中可以看出,在1 ～ 2h之间,α - 亚麻酸的含量呈上升趋势,即随着包合时间的延长,更有利于不饱和脂肪酸与β - 环糊精形成包合物。当包合时间为2h时,β - 环糊精与不饱和脂肪酸达到了最佳的包合状态,此时提取效果最好,α - 亚麻酸的含量为50. 8%,之后随着时间的增加,β - 环糊精失去了包合的能力,开始不再对不饱和脂肪酸进行包合,α - 亚麻酸的含量也开始逐渐降低,由此可见,2h为α - 亚麻酸的最佳包合时间。

图3 包合时间对α - 亚麻酸含量的影响Fig. 3 The effect of inclusion time to α - linolenic acid content

2. 2. 3 β - 环糊精用量对α - 亚麻酸含量的影响结果与分析 从图4中可以看出,当β - 环糊精的用量在12 ～ 21g之间增加时,α - 亚麻酸的含量也在逐渐增加,这是由于β - 环糊精包合不饱和脂肪酸的能力在不断增强,直到其达到最佳的包合程度,此时,β - 环糊精用量为21g时,α - 亚麻酸的含量为51. 5%。但是,当β - 环糊精用量超过21g之后,β - 环糊精包合能力开始下降,这时α - 亚麻酸的含量也开始下降。这是由于β - 环糊精与液体的用量比不随温度或在加成前其他组份的浓度而变化,β - 环糊精与脂肪酸的比随脂肪酸的饱和度不同而不同。

图4 β - 环糊精用量对α - 亚麻酸含量的影响Fig. 4 The effect of β - cyclodextrin dosage to α - linolenic acid content

2. 2. 4 冷冻时间对α - 亚麻酸含量的影响结果与分析 从图5中可以看出,在相同条件下,随着冷冻时间的延长,有利于β - 环糊精对不饱和脂肪酸的包合,在6 ～ 18h之间,α - 亚麻酸的含量一直在增加,当冷冻时间增加到18h时,具有最佳的提取效果,α - 亚麻酸的含量为47. 8%,此时,β - 环糊精对不饱和脂肪酸的包合能力已达到极限。之后随着冷冻时间的增加,β - 环糊精包合能力下降,α - 亚麻酸的含量逐渐下降。由此可以得出结论:18h为α - 亚麻酸的最佳冷冻时间。

图5 冷冻时间对α - 亚麻酸含量的影响Fig. 5 The effect of freeze time to α - linolenic acid content

2. 3 响应曲面法优化α - 亚麻酸提取工艺条件结果与分析

2. 3. 1 回归模型的建立 经过对包合温度、包合时间、β - 环糊精用量以及冷冻时间四个因素进行方差分析,得出:冷冻时间对α - 亚麻酸的含量没有显著性的影响,因此,在接下来的响应曲面实验中将不再将冷冻时间作为主要因素加以考虑。

利用Design Expert软件对表3数据进行多元回归拟合,获得β - 环糊精法提取α - 亚麻酸的包合温度(x1)、包合时间(x2)和β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量之比(x3)的二次多项回归模型方程为:

Y=69. 74 - 0. 62x1+2. 72x2+1. 96x3- 0. 93x1x2+0. 24x1x3+0. 49x2x3- 1. 28x12- 2. 64x22- 9. 43x32

2. 3. 2 方差分析 通过Design - Expert软件进行误差分析,以验证模型的显著性,结果见表4及表5。

表3 实验设计与结果表Table 3 Design and results of experiment

表4 响应面模型方差分析表Table 4 Response surface model analysis of variance table

注:p<0. 0001 极显著,p<0. 05显著,表5同。

从表5回归方程系数显著性检验可知,模型一次项x2、x3极显著,x1显著;交互项x1x2、x2x3显著,x1x3不显著;二次项x12、x22、x32均极显著。

2. 3. 3 α - 亚麻酸质量浓度的响应面分析

2. 3. 3. 1 包合温度与包合时间交互作用 由图6可知,在β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)的用量比值为最佳值7. 14∶ 1时,包合温度与包合时间对α - 亚麻酸含量的交互影响效应。从其等高线图可以直观地看出两因素的交互作用显著。其中,包含温度对α - 亚麻酸含量的影响不大;而随着包合时间的增加,α - 亚麻酸的含量逐步提高,当包合时间较短时,α - 亚麻酸的含量包合时间的增加而增大,但当包合时间超过2. 18h时,α - 亚麻酸的含量随包合时间的增加而减小。在实验水平范围内,包合温度和包合时间分别在59 ～ 61℃和1. 5 ～ 2. 5h范围内时,α - 亚麻酸的含量可以达到实验中的最大值。

表5 回归方程系数显著性检验Table 5 Significance test of the regression equation coefficients

图6 包合温度、包合时间及其交互作用对α - 亚麻酸含量影响的响应曲面Fig. 6 Influence of bonding temperature,inclusion time and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

2. 3. 3. 2 包合温度与β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量比交互作用 由图7可知,在包合时间为最佳值2. 18h时,包合温度与β - 环糊精:(FFA+无水乙醇)对α - 亚麻酸含量的交互影响效应。从其等高线图可以直观地看出两因素的交互作用不显著。在实验水平范围内,包合温度对α - 亚麻酸的含量的影响不大。当β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)比较低时,α - 亚麻酸的含量随β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)比的增大而增大,但当包合温度超过59. 71℃时,α - 亚麻酸的含量随β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)比的增大而减小。在实验水平范围内,包合温度和β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量之比分别在59 ～61℃和6∶ 1 ～ 8∶ 1范围内时,α - 亚麻酸的含量可以达到实验中的最大值。

2. 3. 3. 3 包合时间与β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量比交互作用 由图8可知,在包合温度为最佳值59. 71℃时,包合时间与β - 环糊精:(FFA+无水乙醇)对α - 亚麻酸含量的交互影响效应。从其等高线图可以直观地看出两因素的交互作用显著。随着β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量比值的增加,α - 亚麻酸的含量也逐步提高,当β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)用量比值超过7. 14∶ 1时,α - 亚麻酸的含量开始减小。在实验水平范围内,包合时间和β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)的比值分别在1. 5 ～ 2. 5h和6∶ 1 ～ 8∶ 1的范围内时,α - 亚麻酸的含量可以达到实验中的最大值。

图7 包合温度、β - 环糊精:(FFA+无水乙醇)及其交互作用对α - 亚麻酸含量影响的响应面Fig. 7 Influence of bonding temperature,the ratio of β - cyclodextrin with mixed fatty acids and ethanol consumption and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

图8 包合时间、β - 环糊精:(FFA+无水乙醇)及其交互作用对α - 亚麻酸含量影响的响应面Fig. 8 Influence of inclusion time,the ratio of β - cyclodextrin with mixed fatty acids and ethanol consumption and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

2. 3. 4 验证实验结果分析 根据回归方程及上述分析,响应面存在最大值,可得α - 亚麻酸纯化的最佳工艺条件,即:包合温度59. 71℃,包合时间2. 18h,β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)的用量之比为7. 14∶ 1,得到α - 亚麻酸的含量为71. 47%。优化此工艺条件,即:包合温度60℃,包合时间2. 2h,β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)的用量之比为7. 14∶ 1,采用此工艺做验证实验,结果如表6所示。

表6 回归模型验证实验结果表Table 6 Table results of test model

由表6可看出,采用此工艺条件进行验证实验,得到α - 亚麻酸的含量为71. 45%,与理论值相差不大,因此确定最佳工艺条件为包合温度60℃,包合时间2. 2h,β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)的用量之比为7. 14∶ 1。

3 结论

以亚麻籽油为原料,研究β - 环糊精包合法纯化α - 亚麻酸的最佳工艺条件。通过紫外谱扫描确定α - 亚麻酸的最大波长为300nm。通过单因素实验确定α - 亚麻酸的最佳纯化工艺条件:即包合温度60℃,包合时间2h,β - 环糊精用量21g,冷冻时间18h为最优条件。通过响应曲面法优化α - 亚麻酸的提取纯化工艺条件:即包合温度60℃,包合时间2. 2h,β - 环糊精与(FFA+无水乙醇)的用量比为7. 14∶ 1的数据结果显著,得到α - 亚麻酸的含量为71. 45%。

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