徐红梅，何从林，熊文娟，韦燕禅，夏仕文

（重庆邮电大学生物信息学院，重庆400065）

磷酸肌酸（phosphocreatine，PCr）是参与细胞能量代谢的重要物质之一，具有重要的药理作用，如用于心脏外科手术病人术后心脏功能恢复、治疗心肌梗塞等［1］。磷酸肌酸的制备方法主要有化学法和酶催化法。最早的化学法以肌酸和三氯氧磷为原料合成磷酸肌酸［2］，存在反应条件苛刻、成本高、产率低且环境污染严重等问题，尤其是钡盐的引入增加了制剂的危险性。美国专利［3］采用S－甲基异硫脲为原料，以二苄氧基磷酰化、氧化得到氰基磷酰胺，后者与肌氨酸缩合脱苄基再水解得到磷酸肌酸。汤磊等［4］以肌酐为原料，与二苯氧基磷酰氯缩合得到二苯氧基磷酰肌酐，再用二氧化铂催化氢解脱去苯基，得到磷酸肌酐二钠盐，经碱性水解得到磷酸肌酸，总收率35.5%。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是一种转移性磷酰化酶，在碱性条件下可逆性催化肌酸和三磷酸腺苷（ATP）的转磷酰基反应生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷（ADP），用于合成磷酸肌酸具有反应条件温和、成本低廉、环境友好等特点［5］。但游离肌酸激酶只能一次性使用，而且作为外源蛋白会带来分离困难、可能与磷酸肌酸原料药和制剂发生免疫原性反应等问题。

为寻求更理想的磷酸肌酸酶法合成工艺，作者提出一种新的肌酸激酶无载体固定化方法制得交联肌酸激酶聚集体，并以肌酸和ATP为原料、交联肌酸激酶聚集体为催化剂合成磷酸肌酸（图1）。

图1 交联肌酸激酶聚集体催化合成磷酸肌酸Fig.1 Synthesis of phosphocreatine catalyzed by cross－linked creatine kinase aggregates

1 实验

1.1 试剂

肌酸，郑州皇朝化工产品有限公司；ATP，湖北鸿运隆药业有限公司；磷酸肌酸、ADP、葡聚糖（MW＝40 000，国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为市售国产分析纯或色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 肌酸激酶的分离纯化

按文献［6］方法从兔肌中分离纯化肌酸激酶。

1.2.2 交联肌酸激酶聚集体的制备

取2g葡聚糖溶于50mL蒸馏水中，加入2.4g高碘酸钠，室温搅拌90min，反应液透析至酸性淀粉碘化钾溶液检查无蓝色，得56mL氧化葡聚糖溶液；向20mL肌酸激酶酶液中加入60mL 95%乙醇，4℃下搅拌2h，得到肌酸激酶聚集体；再向其中加入40 mL氧化葡聚糖溶液，室温下反应12h；最后加入20 mL 1mg·mL－1硼氢化钠溶液，搅拌反应2h，固体用纯水洗涤2～3次，得到交联肌酸激酶聚集体。

1.2.3 酶催化反应

在含有60mmol·L－1肌酸、20mmol·L－1ATP和25mmol·L－1醋酸镁的300mL 0.1mol·L－1甘氨酸－氢氧化钠缓冲溶液（pH值9.0）中，加入36g交联肌酸激酶聚集体（湿重），30℃下振荡反应6h。反应过程中通过滴加2mol·L－1氢氧化钠溶液控制反应体系的pH值为9.0。

1.2.4 蛋白质测定

酶蛋白浓度采用Bradford［8］分光光度法测定，以牛血清白蛋白为标准。

1.2.5 酶活测定

在含有60mmol·L－1肌酸、20mmol·L－1ATP和25mmol·L－1醋酸镁的20mL 0.1mol·L－1甘氨酸－氢氧化钠缓冲溶液（pH值9.0）中，加入适量游离酶、相当酶量的肌酸激酶聚集体或交联肌酸激酶聚集体，30℃下振荡反应10min，加2mol·L－1盐酸溶液终止反应。采用HPLC测定磷酸肌酸的量，计算酶活。

1个酶活单位定义为：30℃下1min内催化生成1μmol磷酸肌酸对应的酶量（mg）。

1.2.6 分析方法

HPLC色谱条件：C18色谱柱（250mm×4.6 mm），流动相20mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液（pH值6.6），流速1mL·min－1，检测波长210nm，柱温25℃。采用HPLC同时测定磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP。

2 结果与讨论

2.1 交联肌酸激酶聚集体制备条件的优化

2.1.1 沉淀剂的影响

比较了硫酸铵、叔丁醇、聚乙二醇－6000、乙醇等沉淀剂对肌酸激酶聚集体形成的影响，结果见表1。

表1 沉淀剂对肌酸激酶沉淀率和相对酶活性的影响／%Tab.1 Effect of precipitant on creatine kinase precipieation rate and relative enzyme activity／%

由表1可知，以50%叔丁醇为沉淀剂时，不能形成肌酸激酶聚集体；以80%硫酸铵、20%聚乙二醇－6000为沉淀剂时，肌酸激酶的沉淀率较低，分别只有20%和10%；以95%乙醇为沉淀剂时，沉淀率达到90%，与游离酶相比的相对酶活性为65%。故选择适宜的沉淀剂为95%乙醇。

2.1.2 交联剂的影响

分别以戊二醛、京尼平、氧化葡聚糖为交联剂对乙醇沉淀的肌酸激酶聚集体进行共价交联，考察交联剂对交联肌酸激酶聚集体活性的影响，结果见表2。

表2 交联剂对交联肌酸激酶聚集体相对酶活性的影响／%Tab.2 Effect of cross－linker on relative enzyme activity of cross－linked creatine kinase aggregates／%

由表2可知，小分子交联剂戊二醛、京尼平能够交联肌酸激酶聚集体，但相对酶活性很低，采用大分子交联剂氧化葡聚糖制备的交联肌酸激酶聚集体具有中等的相对酶活性。故选择适宜的交联剂为氧化葡聚糖。

2.2 交联肌酸激酶聚集体的催化性能

2.2.1 最适反应pH值和pH稳定性

在不同pH值（4.0～12.0）下测定游离酶和交联肌酸激酶聚集体及在30℃处理2h后的相对酶活性，结果分别见图2、图3。

图2 交联肌酸激酶聚集体的最适pH值Fig.2 The optimum pH value of cross－linked creatine kinase aggregates

由图2可知，游离酶和交联肌酸激酶聚集体的最适pH值分别为9.0和10.0。交联肌酸激酶聚集体的最适pH值向碱性方向偏移了1个单位。

由图3可知，在所选择的pH值范围内尤其是在碱性条件下，交联肌酸激酶聚集体的稳定性明显高于游离酶。

2.2.2 最适温度和温度稳定性

在不同温度（10～60℃）下测定游离酶和交联肌酸激酶聚集体及在pH值9.0、50℃下处理不同时间的相对酶活性，结果分别见图4、图5。

图3 30℃下处理2h的交联肌酸激酶聚集体的pH稳定性Fig.3 The pH stability of cross－linked creatine kinase aggregates treated at 30℃for 2h

图4 交联肌酸激酶聚集体的最适温度Fig.4 The optimum temperature of cross－linked creatine kinase aggregates

由图4可知，游离酶的最适温度为40℃，交联肌酸激酶聚集体的最适温度为50℃，交联肌酸激酶聚集体的最适温度提高了10℃。

图5 50℃下交联肌酸激酶聚集体的热稳定性Fig.5 The thermal stability of cross－linked creatine kinase aggregates treated at 50℃

由图5可知，游离酶和交联肌酸激酶聚集体的相对酶活性随处理时间的延长而急剧下降，30min时分别为50%和85%；180min时游离酶几乎完全失活，交联肌酸激酶聚集体仍有25%活性保留。显然，交联肌酸激酶聚集体的热稳定性明显高于游离酶。

2.2.3 交联肌酸激酶聚集体的操作稳定性

测定交联肌酸激酶聚集体催化合成磷酸肌酸的时间进程，结果见图6。

图6 交联肌酸激酶聚集体催化合成磷酸肌酸的时间进程Fig.6 The time course of synthesis of phosphocreatine catalyzed by cross－linked creatine kinase aggregates

由图6可知，反应4h后达到平衡，转化率（以ATP计）为74%。

反应液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP的HPLC分离效果见图7。

图7 反应液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP的HPLC分离效果Fig.7 Separation of phosphocreatine，creatine，ATP and ADP in reaction solution by HPLC

由图7可知，HPLC分离反应液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP效果良好，保留时间分别为2.7min、3.6min、4.3min和4.8min。

将交联肌酸激酶聚集体与肌酸、ATP在30℃、pH值9.0的条件下，混合反应4h，用Tris－HCl缓冲溶液（pH值9.0）充分洗涤后测定酶活，考察固定化酶的重复使用稳定性，结果见图8。

由图8可知，交联肌酸激酶聚集体使用4批次后，酶活保留90%以上；使用12批次后，酶活仍保留50%以上。

图8 交联肌酸激酶聚集体的操作稳定性Fig.8 The operational stability of cross－linked creatine kinase aggregates

2.3 讨论

制备交联酶聚集体通常以戊二醛为交联剂［8］，大分子交联剂的运用鲜有报道［9］。兔肌肌酸激酶是二聚体，由2个相同亚基组成，每个亚基又由387个氨基酸残基组成，每个酶分子中存在8个巯基。本研究发现：以戊二醛为交联剂时，由于其高反应性和小尺寸，会与作为肌酸激酶结合或催化位点的巯基反应导致失活；以大分子多醛如氧化葡聚糖为交联剂时，肌酸激酶的相对酶活性很高。可能是因为尺寸较大的氧化葡聚糖较难进入肌酸激酶的活性腔与催化相关的半胱氨酸残基反应，因而有较高的相对酶活性。

肌酸激酶可逆性催化肌酸和ATP的转磷酰化反应，在碱性条件下，正反应的反应速度远大于逆反应。与游离酶相比，交联肌酸激酶聚集体具有更高的最适pH值、最适温度，更好的pH稳定性、热稳定性以及操作稳定性。通过反应条件如pH值、温度、交联肌酸激酶聚集体用量的优化，并结合提高反应底物之一肌酸浓度的策略，能够有效提高磷酸肌酸的收率。

3 结论

（1）从兔肌中分离纯化出肌酸激酶，经95%乙醇沉淀得到肌酸激酶聚集体，再以氧化葡聚糖为交联剂制备交联肌酸激酶聚集体，沉淀率为90%，相对酶活性为58%。交联肌酸激酶聚集体的pH稳定性和热稳定性显著高于游离酶。

（2）交联肌酸激酶聚集体在碱性条件下催化肌酸和ATP合成磷酸肌酸，转化率（以ATP计）为74%。交联肌酸激酶聚集体可重复使用12批次。

（3）与采用小分子交联剂戊二醛相比，以大分子交联剂氧化葡聚糖制备交联肌酸激酶聚集体，能显著减少酶活损失并有效提高其操作稳定性，适合磷酸肌酸的规模化合成。

［1］ 侯立向.一种心肌保护剂：磷酸肌酸［J］.生物化学与生物物理进展，2003，32（2）：324－327.

［2］ 赵春山.磷酸肌酸钠的合成研究［J］.哈尔滨理工大学学报，2004，9（4）：124－126.

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［4］ 汤磊，王建塔，朱高峰.磷酸肌酸二钠的制备［J］.中国医药工业杂志，2009，40（3）：172－173.

［5］ 侯立向.一种磷酸肌酸的生产方法：中国，ZL02129203.5［P］.2005－07－20.

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［7］ BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（7）：248－254.

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［9］ MATEO C，PALOMO J M，van LANGEN L M，et al.A new，mild cross－linking methodology to prepare cross－linked enzyme aggregates［J］.Biotech Bioeng，2004，86（3）：273－276.