张学超 陈至坤 崔传金 （河北联合大学电气工程学院 河北 唐山 063000）

奶牛乳腺炎(Cow Mastitis)是指奶牛乳腺组织由病原微生物感染所引起的炎症反应，是奶牛所有疾病中发病率最高，危害最为严重的一种疾病，美国每年因奶牛乳腺炎造成的经济损失高达20亿美元[1,2]。中国每年的牛奶产量为3555.8万t[3]，而中国广东气候炎热潮湿，奶牛的隐性乳腺炎平均月发病率为30%，季度平均发病时间为13%，受感染的奶牛平均感染时间为两个季度，所以控制奶牛隐性乳腺炎的发病率显得尤为重要[4]。

新鲜牛奶中的体细胞数量(SCC)与奶牛乳腺炎[5,6]、牛奶质量密切相关。不同患病程度的乳腺炎奶牛，其体细胞数量不同、细胞大小百分比也不同[7]。体细胞含量已经作为许多国家监控牛群健康状况、牛奶质量和牛奶定价收购的重要指标[8]。因此，如何实现牛奶中体细胞的准确、快速、在线检测具有重要意义。

传统体细胞数检测存在检测时间长、操作复杂、成本高和不能在线检测的问题[2,9]，而使用电参数检测法来检测体细胞数量，并与美国加州牛乳腺检测方法(California Mastitis Test, CMT)[10]相对比，来间接判断奶牛乳腺炎患病程度、牛奶质量，是未来乳品检测行业发展的主流方向，而电检测方法具有快捷方便的特点和在线检测的应用前景[9]。

在电导率检测乳腺炎中，温度对牛奶的电导率影响很大[11]。但是，目前从细胞电容的角度研究电容值、细胞含量和细胞大小百分比之间关系的文章比较少。Xiong Z Q[12]等研究了在发酵过程中，发现生物量与电容值之间的关系之间存在线性关系和Shramik Sengupta[13]等研究了大肠杆菌在培养基上生长代谢的情况，发现微生物数量与电容值之间也存在线性关系。这都是因为微生物、细胞的表层是不导电的原生质膜结构[14]。当具有完整膜结构的微生物处于电场中时，在电场力作用下微生物会表现出微小电容效应，微生物含量与电容值呈正相关[13,15]。

本文通过微通道电化学传感器测取不同细胞含量新鲜奶样的电容值，用电容、温度和细胞大小百分比3参数建立预测体细胞含量的神经网络模型，以其达到准确、快速、在线诊断奶牛乳腺炎和评判牛奶质量的目的。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

日本HIOKI3532-50 LCR测试仪、BCD-219SKDE冷藏柜、高精度温度计(精度为0.001℃)、培英THZ-C恒温振荡器、奥林巴斯CX21生物光学显微镜等。主要数据分析处理采用Matlab7.3软件。

1.2 试验方法

1.2.1 奶样采集 奶样采自100多头正常生理期[11]的同一品种黑白花奶牛。采样时先用温开水擦拭乳头，然后用75%的酒精对乳头进行消毒，并用医用棉签擦干，弃去前两次挤出的牛奶，再进行奶样采集。每个乳区的牛奶分别挤入50ml干净的带有编号玻璃瓶内密封。在运输过程中放入装有冰袋的隔热泡沫塑料盒内进行保鲜。最后将当天采集到的奶样带回实验室测试，来不及马上测试的奶样需4℃冷藏保存，防止牛奶变质影响测试。

1.2.2 细胞含量测定 牛奶中体细胞含量的测定采用改进的显微镜直接计数法。奶样取回后，将装有奶样的奶样瓶放入恒温振荡器中，在40℃的恒温水浴锅中震荡15min后取出[16]，使得细胞均匀地悬浮在牛奶中，同时配置碘酊染液：每毫升生理盐水中滴加质量分数为2%的碘酊3滴，混匀即可，现用现配。再用移液枪吸取0.1ml的奶样注入编号试管内，再用移液枪吸取1.9ml碘酊染液注入试管内，轻轻摇动，混合均匀，静置3～5min。最后用移液枪吸取少量染色后的奶样(约半滴)轻轻接触盖玻片和计数板的结合处，让其自动流入并充满计算室，然后进行显微镜计数，在目物镜15×40的放大倍数下，将计算室四角4个大方格内的全部体细胞按顺序计数；调节显微镜倍数，计算不同直径范围内的细胞占细胞总数的百分比。为避免重复和遗漏，采用“数上不数下，数左不数右”的计数原则，即对压在方格左边和上边线上的体细胞计在本格内。最后，牛奶体细胞含量按公式计算：SCC=T×5 ×104(1)。式中：SCC―牛奶中每毫升的体细胞含量(个/ml)；T―4个大方格内的体细胞数目之和。

试验中，同一奶样重复镜检计数4次，取其平均值作为奶样体细胞含量，并记录不同直径范围内的细胞占细胞总数的百分比，见表1。共测取了80份奶样，并根据细胞含量和加利福尼亚CMT标准[17]，将奶样划分到5个不同的等级，见表2。

表1 新鲜牛奶样品中细胞大小的百分比 (万个/ml，mm)

表2 CMT法检测奶牛乳腺炎的标准

1.2.3 牛奶电容测量 因为温度对测量牛奶电容值的影响较大，所以测量过程中需记录并保持被测奶样温度。使用HIOKI 3532-50 LCR测试仪测量并记录奶样电容值。为避免测试奶样之间的交叉污染，每测完一个奶样后，注射器和传感器都必须用蒸馏水清洗干净，并用一定量的下一个奶样冲洗3次，在进行该奶样的测试。所有的奶样都在采集后的12h内全部测试完毕。

2 微通道电化学传感器的设计

电极材料采用99.99%的高纯度铂金材料，购于天津艾达恒晟科技发展有限公司。电极体材料和微通道管体材料采用透明、绝缘性好的聚四氟乙烯材质。电极引线采用铜质屏蔽线。为突出容抗的作用，根据Xc=1/(c)= 1/(2fc)（2）式中：Xc—容抗、c—电容、—电极两端激励源信号角频率、f—激励源信号频率。在激励源信号频率一定的情况下，要想得到较高的容抗，根据c=A/L(3)式中：—电容率、L—电极间距离、A—电极横截面积。正是从减小电极横截面积和增加传感器长度两方面来增加容抗，所以设计了微通道电化学传感器。

3 细胞含量神经网络预测模型

BP(Back Propagation)算法是目前应用最为广泛的神经网络学习算法，可实现输入和输出间的任意非线性映射，具有一定的泛化功能[18]。将奶样的电容、温度和细胞大小百分比3个向量作为网络的输入，输入层神经元数为3。网络的输出向量为体细胞数，输出层神经元数为1。该网络采用了2个隐层。两隐层之间传递函数为Tansig，输出层函数为Purelin，训练函数选用trainlm。在网络训练前，将数据用mapstd()标准化函数进行了标准化预处理，以避免数据饱和并加速网络的收敛速度。

通过调整隐层的节点数和相关的训练参数对网络结构进行了优化试验。经过多次的训练仿真，发现当最大迭代次数为10000，误差性能目标值为0.1。网络模型的两隐层神经元数为6和4时结果较为满意，模型结构为3-6-4-1，如图1所示。

图1 模型网络结构

3.1 模型分析

模型的评价指标和预测结果分别见图2、3和表3、4。由表3可知，模型的相关性很高，相关系数R达到了0.9916，模型均方根误差RMSE为6.3094；预测集的预测相关系数Rp也达到了0.9963；预测均方根误差RMSEp为10.2916。由图2可以看出，模型的拟合效果比较满意，决定系数也较高，R2为0.9833。因此说明所建立的奶牛乳腺炎的检测模型基本可靠。

图2 模型输出值与实际值线性回归图

图3 模型预测输出值与实际值线性回归图

表3 模型评价参数

表4 各级正确检出率

3.2 模型预测结果与分析

由图3可以看出，模型的预测决定系数R2为0.9926。表3中，模型对9个剩余奶样进行建模预测，正确预测检出率为89.58%；80个奶样的总体检出率为78.8%与S.Ankinakatte[19]等研究的用神经网络检测乳腺炎的灵敏度75%基本吻合。N级和T级正确检出率偏低，分别为73.56%和65.78%。但是1级和2级正确检出率明显提高，分别达到89.03%和94.32%。原因很可能是由于体细胞含量，在N级和T级中，细胞含量总体上比较低，所产生的电容信息比较少，而极化产生的界面电容占总电容比重较大[13]，因此，测取的电容值不能很好地反映低浓度细胞含量，最终导致N、T级的检出率偏低。另外，T级正确检出率略低于N级，可能是T级的奶样数目较少所致。1级和2级的正确检出率较高，可能是体细胞的浓度较高，细胞极化电容占总电容比重升高，这时所测电容值就能很好地反映体细胞含量，细胞含量越高，这种关系就越显著，而2级中的奶样体细胞含量不低于120万/ml，所以正确检出率就达到了94.32%。

4 结论

通过使用微通道电化学传感器来检测牛奶体细胞电容值，结果表明：电容值、温度和和细胞大小百分比与体细胞含量之间有着密切关系，细胞含量越高，检测效果越好。但在较低细胞含量下关系并不明显，这是因为界面极化电容淹没了有用的奶体电容。所以，从减小界面电容着手，深入研究微通道电化学传感器结构，提高传感器检测精度一个重要的研究课题。

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