柴瑞娟，孙 晨

（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000）

灰树花水提物的提取及其抑菌功能

柴瑞娟，孙 晨

（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000）

为研究水溶液提取灰树花营养成分，采用水溶液对灰树花多糖进行了单因素及正交实验提取，用苯酚-硫酸法对多糖进行了测定。并用滤纸片法研究了灰树花水提物的抑菌能力。正交实验结果表明，影响灰树花多糖提取率的因素大小顺序依次是：温度、液料比、提取时间。灰树花多糖的提取最优条件为：温度80℃、液料比60∶1（mL∶g）、提取时间2.0h。灰树花水提物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用，抑菌圈直径分别为8.74、10.23、12.42mm。

灰树花，水提物，正交实验，多糖，抑菌性能

真菌多糖生物活性复杂而广泛，其中，免疫调节活性是研究最主要的活性，临床上真菌多糖可以作为免疫调节剂用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和肿瘤等疾病的治疗，如香菇多糖可剂量依赖性地提高IL-2和TNF-α的基因表达水平和活性，这表明香菇多糖可诱导某些免疫反应[1]。灰树花（Grifola frondosa）属担子菌亚门、多孔菌科，其主要活性成分是灰树花多糖，因其有β-（1→6）[2-3]分支，可以抑制肿瘤生长防止肿瘤细胞转移、防止正常细胞癌变。

目前研究较多的是灰树花多糖的提取，传统的热水辅以微波[4]、超声波[5]等手段可以提高灰树花多糖的提取率，这些方法适合工厂化或实验室，现实生活中，却难以走进普通人家。本文以水提法为基础，探讨提取温度、液料比和时间对灰树花水提物浸提率的影响，为日常饮食中灰树花多糖的摄取提供参考，因此以水溶性多糖为指标表征提取率。灰树花提取物可以清除自由基[6]，但其抑菌功能还少见报道，本文研究了灰树花水提物的抑菌性能，为灰树花水溶性成分的生理活性研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灰树花（Grifola frondosa） 购于福建省古田县大丰工贸有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus） 本实验室保藏；葡萄糖、95%乙醇、苯酚、浓硫酸 国药集团化学试剂有限公司；青霉素 华北制药股份有限公司。

CN0250型电子天平 上海民桥精密科技仪器有限公司；YM30型全自动电热压力蒸汽消毒器 上海三申医疗仪器有限公司；250B型数显生化培养箱、TGL-16C型高速台式电动离心机、HH-2型数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 参考文献[7]准确称取干燥至恒重的葡萄糖50mg，蒸馏水定容至100mL，再准确吸取5mL该溶液，蒸馏水定容至100mL，得25μg/mL的葡萄糖溶液。称取苯酚6g，溶于蒸馏水并定容至100mL，即得6%苯酚溶液，棕色瓶中避光保存。分别取25μg/mL的葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于空白干净试管，每管分别加入6%苯酚溶液1.0mL和浓硫酸各5.0mL，用蒸馏水补足到8.0mL后摇匀放置20min。以不加葡萄糖标准溶液的0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490mm）测定吸光度。

1.2.2 单因素实验 取6.0g灰树花烘干（60℃），粉碎机粉碎，对温度，液料比和提取时间进行多糖提取单因素实验。3000r/min离心15min后，得到灰树花多糖提取液，稀释100倍，用移液管取1mL到试管中，依次向试管中加入1.0mL蒸馏水、1.0mL 6%苯酚溶液、5.0mL浓硫酸，利用苯酚硫酸法[8]测得反应后的溶液OD值，根据葡萄糖标准曲线读出OD值对应的多糖浓度，重复3次。

1.2.2.1 温度对灰树花多糖提取率的影响 液料比40∶1（mL/g），温度分别为50、60、70、80、90℃，恒温水浴浸提2.0h研究温度对灰树花多糖提取的影响。

1.2.2.2 液料比对灰树花多糖提取率的影响 液料比10∶1、25∶1、40∶1、60∶1、80∶1，60℃的恒温水浴浸提2.0h，研究液料比对灰树花多糖提取率的影响。

1.2.2.3 提取时间对灰树花多糖提取率的影响 液料比40∶1，60℃恒温水浴浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，研究提取时间对灰树花多糖提取率的影响。

1.2.3 灰树花多糖的提取正交实验 因此根据单因素实验结果，设计三因素的正交实验，研究灰树花多糖的提取，重复3次。

表1 灰树花多糖水提正交实验因素水平表Table 1 Design of the orthogonal test of extracting polysaccharide from Grifola frondosa

1.2.4 灰树花水提物的最小抑菌浓度（MIC） 最小抑菌浓度是指抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度，可用于定量测定体外抗菌活性。按正交实验的验证实验结果提取灰树花水提物，此水提物为原液，用两倍法稀释成1∶2、1∶4、1∶8浓度梯度。采用滤纸片法[9]（直径6mm）考察原液及不同稀释度的灰树花水提物对各供试菌的抑菌效果。并用氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新洁尔灭（1∶2）、青霉素（1.6× 105IU）作相应对比，重复3次。

1.3 灰树花多糖提取率

灰树花多糖提取率的计算式为：

多糖提取率（%）=（多糖浓度（μg/mL）×提取液总体积（mL））/（灰树花质量（g）×106）×100。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线测定

得回归方程：y=0.0264x+0.004，r2=0.9990，表明葡萄糖浓度在0～15μg/mL范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系，可以在此范围内采用上述方法测定葡萄糖含量。（y为吸光度，x为葡萄糖含量μg/mL）。

2.2 单因素实验

2.2.1 温度对灰树花多糖提取率的影响 当温度小于80℃时，灰树花多糖的提取率随着温度的升高而增加，80℃时多糖的提取率最高，而当温度大于80℃时灰树花多糖的提取率有所下降。其原因是：在温度较低时，升高温度可以提高传质效率，有利于多糖的浸提，而当温度高于80℃时，过高的温度会破坏多糖成分，导致提取率有所下降，与陈欣等[10]报道类似。高温（90℃）容易破坏多糖。

图1 温度对灰树花多糖提取率的影响Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

2.2.2 液料比对灰树花多糖提取率的影响 液料比会影响溶质与提取液的接触面积，料液比越大，接触面积越大，多糖就越容易溶出，因此可以看到液料比越大提取率越高。同时液料比在25∶1和40∶1之间时灰树花多糖的提取率随着液料比的增大而增加较快，但因为材料中多糖含量是一定的，当液料比大于40∶1时，基本完全溶出，因此多糖的提取率随着液料比的增大而增加缓慢。

图2 液料比对灰树花多糖提取率的影响Fig.2 Effect of solvent ratio on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

2.2.3 时间对灰树花多糖提取率的影响 不同提取时间条件下灰树花多糖的提取率有所不同，并且在实验提取时间条件范围内（1.5～3.0h），灰树花多糖的提取率随着提取时间的增加而逐渐增加，而当提取时间大于2h时，随着提取时间的增加，灰树花多糖的提取率增加缓慢，因为经过2.0h的提取多糖已基本完全溶出。

2.3 灰树花多糖的提取正交实验

图3 时间对灰树花多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

表2 灰树花多糖的提取三因素正交实验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

极差分析表明温度在实验范围内对灰树花多糖的提取影响相对较大，液料比在实验范围内对灰树花多糖的提取影响其次，而提取时间在实验范围内对灰树花多糖的提取影响相对最小。因此，由灰树花多糖的提取三因素正交实验可以确定灰树花多糖的提取最优条件A3B3C3为：温度80℃、料液比60∶1、提取时间2.0h。

2.4 正交实验验证结果

在最优条件下进行灰树花多糖的提取验证实验（重复3次），灰树花多糖的平均提取率达到7.94%，大于极值，因此正交结果得以验证。

2.5 灰树花水提物的抑菌性能

灰树花水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较明显，在1∶8时即可对金黄色葡萄球菌的生长产生抑制作用，抑菌圈直径达到12.42mm；而对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌作用只有在1∶1时才会显现出来，抑菌圈直径分别为8.74、10.23mm，通过对三种细菌抑菌圈大小的比较可知灰树花水提物对枯草芽孢杆菌的抑菌作用最弱。

与化学物质相比，灰树花水提物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果大约介于氯化汞（0.3%）和青霉素（1.6× 105IU）之间，对大肠杆菌的抑菌效果和青霉素（1.6× 105IU）的抑菌效果接近，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与氯化汞（0.3%）的抑菌效果相当。

表3 灰树花水提物的抑菌性能Table 3 Antimicrobial effects about water extract from G.frondosa

表4 四种化学物质的抑菌性能Table 4 Antimicrobial effects about chemical substances

图4 灰树花水提物对三种细菌的抑菌圈Fig.4 Antibacterial circle of water extract from G.frondosa to bacteria

3 结论

目前市场上有多种以多糖为主要成分的保健品或药品，但一般都价格昂贵，大众难以接受。灰树花多糖也有同样的保健和治疗功能，且子实体味道鲜美，因此可通过日常食用达到保护健康的目的。本研究结果认为温度80℃、液料比60∶1、提取时间2.0h，可使灰树花多糖尽量溶出，即平常食用时小火慢炖会更有利于食材的利用。

本研究表明灰树花水提物有很好的抑菌效力，但灰树花水提物成分复杂，不仅含有多糖，蛋白，矿质离子，还含有挥发成分[11]。虽然真菌多糖也有一定的抑菌效果[12]，但其他小分子化合物如多酚类[13]也会有此功能，本研究中灰树花水提物的具体抑菌成分还有待探讨。

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Water extracts from Grifola frondosa and antimicrobial function

CHAI Rui-juan，SUN Chen
（College of Biochimcal Engineering of Anhui Polytechnic，Wuhu 241000，China）

The purpose of this research was to extract polysaccharide from Grifola frondosa，single factor and orthogonal tests were carried out.The method of phenol-sulfuric acid was used to determine the content of polysaccharide.Antibacterial performance test about water extracts was studied，too.Orthogonal tests showed that optimum conditions of polysaccharide extraction were as follows：extraction temperature 80℃，liquid ratio 60∶1（mL∶g）and extraction time 2.0h.Water extracts from G.frondosa had antibacterial activity to Bacillus subtilis，Escherichia coli and Staphylococcus aureus，and antibacterial circle were 8.74，10.23，12.42mm respectively.

Grifola frondosa；water extracts；orthogonal test；polysaccharide；antimicrobial function

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0299-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.059

2013－07－18

柴瑞娟（1975-），女，硕士研究生，副教授，主要从事微生物学方面的研究。