蔡丽梅，朱珍珍，虞如芬

MTHFR基因多态性、Hcy、B12、叶酸与胚胎停止发育的相关性

蔡丽梅，朱珍珍，虞如芬

目的探讨MTHFR基因多态性、血清同型半胱氨酸（Hcy）、维生素B12及叶酸与胚胎停止发育的相关性。方法选择胚胎停止发育孕妇（胚胎停止组）76例，正常孕妇(正常胚胎组)50例，同龄育龄期妇女（正常育龄组）50例，抽空腹静脉血10m l，苯酚/氯仿法提基因组DNA，PCR扩增、聚合酶反应检测其基因类型，采用双试剂循环酶法测定血浆总Hcy水平，微粒子酶免分析法测定血浆叶酸、维生素B12水平；观察比较3组和各基因类型频率、Hcy、、B12、叶酸值，并进行统计分析。结果胚胎停止组TT基因型和T等位基因所占比率均明显高于正常胚胎组（均＜0.05），CT、CC基因型、C等位基因明显小于正常胚胎组（均＜0.05）；两组内各基因型Hcy值比较均为TT＞TC＞CC（均＜0.05），B12、叶酸值比较均为TT＜TC＜CC（均＜0.05）；两组间TT、TC的Hcy值比较均为胚胎停止组〉正常胚胎组（均＜0.05），B12、叶酸值比较均为胚胎停止组＜正常胚胎组（均＜0.05），两组CC基因型间Hcy、B12、叶酸值比较差异均无统计学意义（＞0.05）。结论MTHFR基因表现为多态性，胚胎停止发育可能与TT基因突变、血清Hcy升高、B12和叶酸值下降有关。

胚胎；停止发育；MTHFR基因；多态性；血清同型半胱氨酸

胚胎停止发育是指妊娠早期因某种原因所致胚胎停止发育，即妊娠早期(受精5周或妊娠7周)后见胚芽而无原始心管搏动，孕囊枯萎或B超图像仅见孕囊而未见胚芽[1]。胚胎停止发育有逐年上升的趋势，它的发生机制十分复杂，除感染、子宫畸形、内分泌异常及染色体异常等因素外，还有60%～70%的原因不明[2]。笔者收集了胚胎停止发育孕妇（胚胎停止组）76例，正常孕妇(正常孕妇组) 50例对MTHFR基因类型及各基因类型的血清同型半胱氨酸（Hcy）、维生素B12、叶酸值，分析MTHFR基因多态性、Hcy、B12、叶酸与胚胎停止发育的相关性，现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2012年6月至2013年6月在温州医科大学附属第三医院就诊的孕妇胚胎停止发育孕妇（胚胎停止组）76例，正常同期孕周孕妇（正常胚胎组）50例。胚胎停止组年龄24～34岁，平均（28.5±2.7）岁；产次1～2次，平均（1.3±0.2）次；孕周7～11周，平均（8.7±1.3）周。正常胚胎组年龄24～34岁，平均（28.3±2.6）岁；产次1～2次，平均（1.3±0.1）次；孕周7～11周，平均（8.6±1.2）周。两组一般资料差异均无统计学意义（均＞0.05）。所有入选患者均签置入选知情同意书。

1.2 胚胎停止发育和正常妊娠诊断标准（1）胚胎停止发育：头臀长度≥7 mm且无心跳；孕囊平均直径≥25mm且无胚胎；无卵黄囊的孕囊2周后不见有心跳的胚胎；有卵黄囊的孕囊11 d后无心跳。（2）正常早孕：月经停止，人绒毛膜促性腺激素（HCG）升高，超声下见妊娠囊内胚芽和胎心搏动。排除标准：随访过程中出现胚胎停止发育者出现流产；高血压、内分泌疾病、急性感染和其他重要脏器疾病。

1.3 方法

1.3.1 超声检查飞利浦HDI5000B超机，探头频率3.5MHz，取平卧位，行纵、横、斜向扫查监测胚胎，观察胚胎心血管搏动及孕囊的大小。

1.3.2 Hcy、叶酸、B12检测抽取空腹静脉血液3m l，高速离心取血清；用Abbott公司生产的IMX型自动生化分析仪、配套Hcy试剂盒、双试剂循环酶法检测Hcy水平(正常值为5～15mmol/L)，用微粒子酶免分析法测定血浆叶酸、B12水平。

1.3.3 MTHFR基因型检测（1）DNA提取：用含细胞保存液的真空管采血3m l，用转速为10 000 r/min的高速离心机离心10 m in，弃上清液，用苯酚/氯仿法提基因DNA，试剂盒由Gibco公司提供。（2）MTHFR基因PCR扩增：用美国ABI公司生产的PE9600型PCR DNA热循环仪扩增仪，剂盒有香港凯善公司提供；引物序列：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’，5’-GGACGGTCCGGTGAGAGTG-3’；反应体系：总体积25 L，其中ddH2O 18.5 l，10×缓冲液2.5 l，10mM的dNTPs 1 l，12.5 pmol/l的引物各1 l，DNA 1 l。反应条件：95℃预变性5min，温度95℃30 s，62℃45 s，72℃50 s，10m in，共30个循环后72℃再延伸10 min，4℃保存，配制2%琼脂糖凝胶(含0.5m l溴化乙锭)。扩增结果观察：取扩增产物5 l，加10 l dd H2O及2 l溴酚兰，混合后电泳(电压

110 V，30m in)，在紫外灯下观察扩增片段大小198 bp，证实扩增成功。(3)酶切反应：扩增产物中加入限制性内切酶HinfⅠ酶切反应体系20 l，该体系包括扩增产物5 l、10倍缓冲液2 l、Hinfl10 l、ddH2O12 l。37℃消化24h，将酶切产物进行电泳30m in。（4）MTHFR基因分型判读：取酶解产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，以溴化乙锭染色，紫外灯下观察、摄片。

1.4 统计方法用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-检验；；两组比较采用检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR基因PCT-RFLP电泳结果CC野生型只有198 bp片段，CT杂合性有198 bp、175 bp、23 bp3条片段，TT纯合突变型有175 bp、23 bp2条片段，2%琼脂糖凝胶电泳后23 bp片段游出，见图1。

2.2 胚胎停止组和正常胚胎组MTHFR基因型频率比较胚胎停止组TT基因型、T等位基因所占比率明显多于正常胚胎组（均P＜0.01），CT、CC基因型和C等位基因明显小于正常胚胎组（均＜0.01）。见表1。

2.3 两组不同MTHFR基因型孕妇血清Hcy、B12、叶酸值比较两组内3种基因型的Hcy值比较，TT＞TC＞CC，差异有统计学意义(均＜0.05)；B12、叶酸值TT＜TC＜CC，差异有统计学意义(＜0.05)。两组间同基因型，TT、TC基因型Hcy值胚胎停止组＞正常胚胎组（9.20、6.68，均＜0.05），B12、叶酸值比较胚胎停止组＜正常胚胎组（=2.82，＜0.05）；两组间CC基因型Hcy、B12、叶酸值差异无统计学意义(≤0.28，均＞0.05)。见表2。

3 讨论

3.1 胚胎停止孕妇和正常孕妇MTHFR基因多态性分析MTHFR是一种黄素蛋白，MTHFR基因定位在1号染色体，基因全长2 220 bp，包含有11个外显子和10个内含子[3]。MTHFR基因多态性位点存在两种等位基因，即野生型C与突变型T，组合为3种基因型：TT、CT和CC。唐仪等[4]认为MTHFR基因多态性发现CT/TT基因型人群患原发性高血压病(EH)的危险性比CC基因型人群高。郑苗苗等[5]对急性淋巴细胞白血病患儿MTHFR基因多态性检测结果发现C677T位点：CC野生型27例(52%)，CT杂合型l6例(31%)，TT纯合型9例(17%)。国内外多项关于MTHFR基因个型分布频率研究结果存在差异的可能原因包括：种族之间等位基因频率的差异、基础疾病、叶酸营养状况、饮食或同时服用的药物等环境因素[6]。本组资料显示胚胎停止组TT基因型和T等位基因所占的比率明显高于正常胚胎组（＜0.05）；CT、CC基因型、C等位基因所占比率明显小于正常胚胎组（＜0.05）因此，笔者认为MTHFR基因多表现为态性，TT基因突变与胚胎停止发育可能存在相关性。

3.2 MTHFR基因多态性、Hcy、B12、叶酸值与胚胎停止发育的关系MTHFR基因有两个不同的等位基因(C和T)，T是与酶的活性下降和同型半胱氨酸血症的风险增加相关[7]。两组组内各基因型Hcy值比较均为TT＞TC＞CC（＜0.05），两组间TT、TC基因型同基因型的Hcy值比较均为胚胎停止组〉正常胚胎组（＜0.05）。两组CC基因型Hcy值比较无显著差异（＞0.05）。由此可见不同MTHFR基因型孕妇其血清同型半胱氨酸值不同，TT基因胚胎停止发育孕妇的其血清同型半胱胺酸值较高，CC基因型者血清同型半胱氨酸值相对较稳定。因此，胚胎停止发育TT基因突变者血清Hcy值相对较高。Hcy多个方面影响血液的凝固性，如改变内皮细胞抗血栓能力、增加纤维蛋白的形成及抑制纤溶酶的活性等从而提高血液的凝固性，降低纤溶性，促进血栓形成[8]。Hcy的生理代谢处于再甲基化作用和转硫化作用这两个代谢途径的交叉点，当血液中Hcy浓度升高，可以造成人体血管堵塞、血管内皮损伤，甚至血压增高[9]。另外统计发现两组内各基因型B12、叶酸值比较均为TT＜TC＜CC（＜0.05）；两组间TT、TC的B12、叶酸值比较均为胚胎停止组〈正常胚胎组（＜0.05）；两组CC基因型间B12、叶酸值比较均无显著差异（＞0.05）。由此可见胚胎停止发育者TT基因者血清B12、叶酸值相对较低，CC基因型者血清B12、叶酸值较TT、TC型稳定。血浆中Hcy浓度与遗传因素及饮食因素有关，如果叶酸、维生素B12摄入不足，甲基化转移障碍，Hcy再不能生成蛋氨酸，可导致血浆Hcy蓄积[10]。MTHFR活性降低使半胱氨酸合

成甲硫半胱氨酸减少，最终血Hcy浓度增加[11]。总之，THFR基因的多态性、血清Hcy、B12和叶酸值相互影响，MTHFR基因TT突变、血清Hcy值升高、B12和叶酸值的降低都会影响胚胎的正常发育，相互之间可能存在明显的相关性。

表1 胚胎停止组和正常胚胎组MTHFR基因型频率比较例（%）

表2 两组不同MTHFR基因型孕妇血清Hcy、B12、叶酸值比较

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.05.054

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A

1671-0800(2014)05-0602-03

温州市科技局科技项目（Y20120288）

325200浙江省温州，温州医科大学第三医院（蔡丽梅、虞如芬）；瑞安市中医院（朱珍珍）

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