殷耒兰,陈 琳,苏 菊,姜 浩,苏 琦,黄卫国,李跃华,唐三元

(1.湖南省胃癌研究中心南华大学附属第一医院肿瘤内科,湖南衡阳421001;2.南华大学医学院肿瘤研究所)

胃癌是全球第4位常见恶性肿瘤,每年大约有98.96万新发病例,73.8万人死于胃癌[1]。胃癌起病隐匿,早期常无特殊的明显症状,也无明显的体征,故发现时多数已发生淋巴结或远处转移,这是导致其预后差、死亡率高的主要原因。DADS在体内外抑制人胃癌MGC803细胞迁移和侵袭能力已有较多的实验依据,其机制可能与下调MMP-9、MMP-2、uPAR,上调 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3,Rac1-Rock1/Pak1通路介导LIMK1下调,抑制cofilin1磷酸化[2-4]等有关。组织学研究发现组织蛋白酶D在胃癌组织中高表达,可能参与胃癌的侵袭转移[5],但DADS是否通过下调Cath-D的表达抑制人胃癌MGC803细胞侵袭转移尚未见报道。本实验进一步探讨DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移和侵袭的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胃癌MGC803细胞株、DADS由南华大学肿瘤研究所惠赠;胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司;LipofectamineTM2000、Trizol试剂购自美国 Invitrogen公司;siRNA由美国 Invitrogen公司设计合成(Cath-D siRNA 序列为:5′-GGATCCACCACAAGTACAA-3′、Control siRNA 序列为 5′-GGACCACAACAATGCTCAA-3′);RT试剂盒、PCR试剂盒购自加拿大Fermentas公司;鼠抗人Cath-D蛋白单克隆抗体购自美国Santa公司。

1.2 细胞培养和转染

人胃癌MGC803细胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中贴壁生长,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞进行转染,转染步骤按照说明书进行,siRNA终浓度为50 nmol/L。培养6 h后更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,转染后24 h收集细胞,作为后续检测。

1.3 RT-PCR检测Cathepsin D mRNA水平

设计并合成半定量RT-PCR引物。Cath-D正义链 5′-CAA CAG CGA CAA GTC CAG C-3′,反义链5′-CTG AAT CAG CGG CAC GGC-3′(597 bp);β-actin为内参照,5′-ATC TGG CAC CAC ACC T-3′,反义链 5′-CGT CAT ACT CCT GCT T-3′(837 bp)。使用Trizol提取细胞中总RNA,RNA逆转录成cDNA,再通过 PCR扩增。……